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Construction du vecteur d'expression et d'expression:
Le vecteur d'expression pSESAME-Cre a été construit en insérant un fragment de Cre-encodage dans pSESAME via des sites de restriction Avril et Nhel utilisant des méthodes de clonage standard. pSESAME code pour une protéine de fusion constituée d'une histidine-tag, TAT-domaine, séquence NLS et la CRE, en abrégé HTNCre. Pour l'expression de HTNCre pSESAME-Cre a été transformé en TUNER (DE3) Placi et utilisés pour préparer un stock de glycérol.
- Une culture durant la nuit a été inoculé avec une pointe de pipette enduits de bactéries transformées par le stock de glycérol. La culture du jour au lendemain se composait de milieu LB supplémenté en glucose 0,5% [v / v] et carbénicilline à une concentration finale de 50 pg / ml et a été autorisé à croître à 37 ° C pendant 16 heures.
- Le lendemain, le plus densément cultivée nuit de la culture a été utilisée pour inoculer la culture d'expression à un ratio de 1 à 40 et a été mis dans un incubateur à 37 ° C. Expression de la culture se composait des médias tuberculose complété par du glucose à 0,5% [v / v] et l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg / mL.
- A une DO 595 de 1,5 à la culture d'expression a été induite avec 0,5 mM d'IPTG pendant 1 h.
- Par la suite les bactéries ont été recueillies par centrifugation à 5000 rpm pendant 10 minutes dans un rotor SLA3000.
- Les bactéries ont été granulés stockés à -20 ° C jusqu'à la purification.
Purification des cellules perméables protéines:
- Frozen granulés bactéries ont été remises en suspension dans 10 ml de tampon de lyse par culture flacon litre pendant 15 minutes à température ambiante.
- La suspension a été ensuite incubés avec 1 mg / ml de lysozyme pour d'autres 15 minutes tout en mélangeant à température ambiante.
- 25 U / mL a été ajouté par la suite benzonase et incubé tout en mélangeant pendant 15 minutes à température ambiante.
- Après sonication sur glace pendant 1,5 minutes avec des impulsions s 0,5 à 45% de la puissance, 1 ml de tampon froid sel tartrique (BST) par ml de suspension a été soigneusement ajouté tout en mélangeant et incubé pendant 5 min sur la glace. SDS-PAGE de la fraction de l'échantillon lysat (L) a été prise.
- Lysat clarifié a été obtenu par centrifugation à 4 ° C pendant 30 min à 30000 g. SDS-PAGE des échantillons de fractions solubles (S) et insoluble (I) ont été prises.
- Le surnageant a été transféré dans de nouveaux tubes de 50 ml Falcon et a ensuite été délicatement mélangés pendant 1 h à 4 ° C avec 2 ml de 50% de Ni-NTA boue par litre de culture d'expression initiale.
- La suspension a été emballé dans une colonne à écoulement par gravité EconoPac (SDS-PAGE de l'échantillon de l'écoulement à travers la fraction (FT) a été prise) et lavé deux fois avec 5 volumes de lit de tampon de lavage. SDS-PAGE des échantillons des deux fractions de lavage (W1 et W2) ont été collectés.
- HTNCre fractions contenant ont été élues avec 3 lits volumes de tampon d'élution et l'échantillon de la fraction d'éluat (E) pour analyse SDS-PAGE a été prise.
- Imidazole a été éliminée par dialyse contre le tampon d'élution fraction élevée de sel à deux reprises.
- La solution de protéine a été encore concentré par dialyse contre du tampon glycérol deux fois. Dans toutes les étapes de dialyse le ratio de tampon d'échantillon a été d'au moins 50. Cette procédure a abouti à une solution stock de glycérol contenant HTNCre à une concentration d'habitude entre 200 et 450 uM, soit 1 litre de culture d'expression se traduira par environ 12 mg de protéine. Exemple de stock glycérol (GS) pour analyse SDS-PAGE ont été recueillis. Solution stock HTNCre peuvent être stockés à moins 20 ° C.
Figure 1: analyse SDS-PAGE des échantillons prélevés pendant le processus de purification de recombinase Cre. L'induction de l'expression de Cre est indiquée par la bande dominante de la fraction lysat. Bien qu'une partie de la protéine est insoluble la protéine Cre peut encore être enrichi comme on le voit dans l'éluat et les fractions d'actions de glycérol. L: lysat, I: Insoluble, S: surnageant, FT: Flow-through, W: linge, E: éluat, GS: Stock Gylcerol. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.
Transduction des protéines dans murin souches embryonnaires (ES) cellules:
- Les cellules ES portant une conditionnelle β-galactosidase journaliste de 5 construire ont été ensemencées en utilisant des cellules individuelles TrypLE ™ Express pour la dissociation des cellules adhérentes. Après 4 à 6 heures, les cellules ont re-joint et le milieu a été enlevé.
- Par la suite les cellules ES ont été incubées avec un milieu contenant du HTNCre pendant 16 heures.
- Une quantité appropriée de protéines HTNCre (correspondant à 10 pM) sur le stock de glycérol a été dilué dans le milieu de ES et filtré par la suite stériles (0,22 m).
- Après moyennes de transduction de protéines a été modifié pour revenir à un milieu de croissance normal.
- Après deux jours cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 10 minutes.
- Deux suppléinternationale étapes de lavage avec du PBS ont été exécutés avant X-Gal coloration a été réalisée.
- Les cellules fixées ont été couverts d'une couche de solution de coloration X-Gal 6 et incubée pendant la nuit à 37 ° C.
Les résultats représentatifs:
Suivant une solution de coloration X-Gal jour a été aspiré et les cellules ont été recouvertes d'une couche de PBS pour l'analyse microscopique. 80 à 100% de cellules recombinées pu être observé dans les cellules ES murines jugés par β-galactosidase.
