Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment

Kelley D. Sullivan; Edward B. Brown

doi:10.3791/1636

Method Article

Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment

DOI:

10.3791/1636

⸱

February 26th, 2010

Kelley D. Sullivan¹ , Edward B. Brown²

¹Department of Physics and Astronomy, University of Rochester, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article nous allons décrire la procédure de mesure de coefficients de diffusion multi-photons en utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment. Nous allons commencer par aligner le laser le long du chemin optique à l'échantillon et la détermination des paramètres expérimentaux appropriés, puis continuer à générer et enfin l'ajustement de courbes de recouvrement de fluorescence.

Abstract

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Multi-fluorescence après photoblanchiment de récupération est une technique de microscopie utilisée pour mesurer le coefficient de diffusion (ou les paramètres de transport analogues) des macromolécules, et peut être appliqué à la fois

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aligner le système optique.

L'équipement clé pour une expérience MP-FRAP comprennent: un mode bloqué source laser, cellule de Pockels (pour le faisceau de modulation), générateur d'impulsions, dichroïques, objectif, émission de fluorescence du filtre, tube photomultiplicateur fermée, et un système d'enregistrement des données (photon contre et multicanaux scaler).

2. Déterminer les pouvoirs de surveiller en toute sécurité.

Atténuer le laser à un faible, mais raisonnable, le pouvoir de générer la fluorescence dans l'échantillon.
Concentrer au sein de l'échantillon.
Définissez un ....

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Discussion

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La puissance du multi-photons de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment réside dans sa capacité à sonder des échantillons épais avec une résolution 3D. Depuis son développement dans les années 1990, MP-FRAP a été utilisée pour déterminer le coefficient de diffusion (ou les paramètres de transport analogue) dans les corps cellulaires, ex vivo des tissus tranches épaisses, et dans les tissus in vivo et l'interstitium. Dans cet article, nous avons présenté l'équipement nécess.......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par un ministère de la Défense de l'ère Scholar Award Espoir (n ° W81XWH-05-0396) et chercheur au Pew le Prix des sciences biomédicales à Edward B. III Brown.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Ti :sapphire laser	Newport Corp.	Mai Tai
Pockels Cell	Conoptics	350-80
Microscope à balayage laser	Olympus Corporation	Fluoview
Miroir dichroïque passe-court	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
Tube photomultiplicateur	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Compteur de photons	Stanford Research Systems	SR 400
Scaler/averager multicanaux	Stanford Research Systems	SR 430
Générateur d’impulsions	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

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