Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

Summary

Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages. Linéarisé λ ADN est modifiée pour avoir une biotine à l'extrémité d'un brin, et un fragment de la digoxigénine sur l'autre extrémité du même brin. La fin biotinylé est attaché à une lamelle de verre fonctionnalisée et la fin digoxigeninated à une petite perle. L'assemblage de ces attaches ADN perlent à la surface d'une cellule de flux permet un flux laminaire à être appliqués à exercer une force de traînée sur le talon. En conséquence, l'ADN est étiré proche et parallèle à la surface de la lamelle à une force qui est déterminé par le débit (Figure 1). La longueur de l'ADN est mesurée par le suivi de la position de la bille. Différences de longueur entre l'ADN simple et double brin sont utilisées pour obtenir des informations en temps réel sur l'activité des protéines de réplication sur la fourche. Mesure de la position de la bille permet une détermination précise des tarifs et processivities de l'ADN de déroulage et de polymérisation (figure 2).

Protocol

1. Modèle de réplication d'ADN

D'ADN pour la réaction est un ADN linéarisé λ modifié par recuit d'oligonucléotides pour former une fourche de réplication. De plus, la biotine est fixé à l'extrémité d'un brin de l'ADN λ, et un groupement digoxigénine est attaché à l'autre extrémité du même brin ^1.

Matériaux: bactériophage λ l'ADN, les oligonucléotides: bras de fourche biotinylé (A: 5'-biotine-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), bras de fourche λ-complémentaire (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTC....

Discussion

Il est important de s'assurer que la force de traînée exercée sur les billes par flux laminaire ne pas influencer les activités enzymatiques des protéines de réplication. Par exemple, une force de 3 PN qui correspond à un débit de 0,012 ml / min n'affecte pas la réplication du brin d'ADN de premier plan. Cela ne va cependant affecter les activités enzymatiques qui ont lieu pendant la synthèse d'ADN coordonnés, et il doit donc être réduite à 1,5 pN. La force de traînée peut être facilement contrôlé en cha.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bactériophage λ ; ADN	New England Biolabs	N3011L
Oligonucléotides d’ADN	intégrés Technologies
T4 ADN Ligase	New England Biolabs	M0202L
T4 Polynucléotide kinase	New England Biolabs	M0201L
&alpha ;-digoxigénine Fab	Roche Group	11214667001
Perles activées par le tosyle	Invitrogen	142-03
Séparateur magnétique	Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triéthoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	D’autres aminosilanes peuvent être utilisés ou mélangés avec des silanes réactifs non amines pour des surfaces plus clairsemées
Propionate de succinimidyle PEG	Nektar		Des PEG similaires peuvent être achetés auprès de Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
			Des PEG similaires peuvent être achetés auprès de Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Ruban adhésif double face	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ ; m d’épaisseur
Glissière en quartz	Verre technique	20 mm (L) x 50 mm (L) x 1 mm (H)	Taille pour s’adapter aux lamelles. Perçage avec forets à pointe diamantée (DiamondBurs.net)
Tube en polyéthylène	BD Biosciences	427416	0,76 mm de diamètre intérieur, 1,22 OD d’autres tailles de tubes peuvent être remplacés.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Faire 1 mg/mL de solution, 25 μ ; L aliquotes dans PBS pH 7.3
Mélange de solution de désoxyribonucléotide triphosphate	New England Biolabs	N0447
Microscope optique inversé avec objectif 10X	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Aimant de terres rares Permament	National Imports	www.rare-earth-magnets.com
Caméra CCD	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Pompe à seringue	Harvard Apparatus	11 Plus	Fonctionne en mode recharge pour faciliter les changements de solution
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1