Préparation des os décalcifiés pour l'histologie, histomorphométrie et analyse Fluorochrome

Résumé

Histologie osseuse décalcifiés fournit des informations importantes pour une variété d'applications cliniques et de recherche. Il est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter.

Résumé

Histologie osseuse décalcifiés démontre la micro-architecture du tissu osseux. Il montre à la fois les composants minéralisés et cellulaires de l'os, qui fournit des informations vitales sur le remodelage osseux ou de la formation et la résorption osseuse. Cela a une importance énorme dans une variété d'applications cliniques et de recherche. Il donne de belles images ¹ et permet de techniques comme l'évaluation et l'histomorphométrie fluorochrome ^2. Analyse fluorochrome est une technique où les colorants fluorescents qui se lient au calcium sont injectés à un point de moment particulier, qui permet de quantifier la quantité de minéralisation à ce moment donné. Histomorphométrie est un processus de quantification des os au niveau microscopique.

Exécution histologie osseuse décalcifiés est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Elle exige des variations dans la technique de celles utilisées dans de la paraffine Embedded Standard histologie. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter. Préparation de l'échantillon, la fixation et le traitement sont réalisés avec une manière similaire à d'autres tissus mous, mais en raison de la densité et la faible perméabilité de l'os considérablement plus longue de fixation et de délais de traitement sont nécessaires, prenant souvent plusieurs semaines. Embedding est réalisé en utilisant un milieu de support avec une dureté semblable ou égal et la densité de l'os comme le méthacrylate de résines à base de mais, contrairement à l'infiltration de paraffine et d'enrobage, il s'agit d'une étape irréversible. Sectionnement peut être réalisé par broyage qui produit une section plus épaisse, ce qui est optimal pour les études telles que l'analyse fluorochrome. Le mieux est réalisé en utilisant une lame de diamant sur une macrotome. Alternativement, des sections plus minces peuvent être produites pour la microscopie optique et ceci est réalisé à l'aide d'un microtome luge avec une lame très aiguisée. Le microtome luge fournit la force supplémentaire et la stabilité requises pour les grands, les blocs durs. Résine sections intégrées peuvent être colorés avec une variété de taches, qui sont démontrés.

Protocole

1. Le tissu est placé dans un récipient scellé contenant du phosphate tamponnée à 10% une solution de formol ^3. Assurer une exposition minimale à la lumière, si l'analyse fluorochrome doit être exécuté, comme les fluorochromes sont sensibles à la lumière.
2. Établir dont l'orientation du tissu sera nécessaire.
3. Coupez le spécimen à la taille, l'orientation correcte, en utilisant une scie à ruban. Mesures de sécurité Assurez-vous sont respectées. L'échantillon est ensuite placé dans un récipient opaque, dont le volume devrait être d'environ dix fois la taille de l'échantillon pour obtenir une fixation adéquate. Le spécimen doit rester dans la solution de formol au total entre un et deux semaines en fonction de sa taille. Il est suggéré d'utiliser des tissus de contrôle fins de test et d'optimisation.
4. Vérifiez le tissu s'inscrit dans le moule enrobage et placer le tissu dans un récipient opaque scellée contenant 70% d'éthanol.
5. Traiter les tissus dans l'ordre croissant des concentrations de l'éthanol, le blindage de la lumière et sous agitation constante.
   1. 70% d'éthanol 1 semaine
   2. 80% d'éthanol 1 semaine
   3. 90% d'éthanol 1 semaine
   4. 100% d'éthanol 1 semaine
6. Le tissu est ensuite effacé au butanol pour 1 semaine, nouveau blindage de la lumière et sous agitation constante.
7. La densité de la résine et l'os devrait être étroitement appariés. La densité de la résine peut être modifiée (voir étape 8) et nous recommandons l'intégration d'un premier spécimen d'analyse afin d'assurer la densité correcte. Nous utilisons Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) pour la microscopie optique et analyse fluorochrome. Si l'immunohistochimie est nécessaire d'une résine de rechange doivent être utilisés tels que Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. La solution la préparation Technovit 7100 peut être mélangé avec de petites aliquotes de la solution adoucissante fourni avec le kit, si nécessaire, mais pas plus de 5% du volume de solution de préparation, dans notre expérience, la solution adoucissante est rarement nécessaire. À parts égales de l'éthanol absolu et Technovit liquide de base 7100 sont mélangés et appliqués au tissu comme une solution de pré-imprégnation pendant 24 heures en minimisant l'exposition lumineuse et avec agitation.
9. La solution d'infiltration est alors faite en utilisant une durcisseur g I (= 1 sac) qui est dissout dans 100 ml de liquide de base. Cela remplace la solution de pré-imprégnation et est autorisé à infiltrer pour 1 semaine sous agitation constante.
10. Placez le tissu dans le moule, avec le visage surface de coupe vers le bas. S'assurer qu'il ya une marge (idéalement au moins 5 millimètres) autour du tissu pour la résine, ce qui assure la force du bloc. Mélanger 15mls de solution Technovit préparation 7100 avec 1 ml de durcisseur II et verser autour spécimen dans le moule et couvrir au moins 5 millimietres. Durcissement débutera dans les 2 heures, mais sera complet durant la nuit.
11. Le montage est ensuite effectué en façonnant un bloc en utilisant la sauvegarde Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mélanger Technovit 3040 dans un rapport volumique de 2 parties de poudre pour 1 partie liquide pour obtenir un liquide visqueux. Verser Technovit 3040 dans le renfoncement à l'arrière du bloc à un niveau d'au moins 2 mm au-dessus de la base du bloc. Après environ 10 minutes, le moule peut être décollée et le bloc est prêt.
12. La densité et donc les propriétés de coupe de résine méthacrylate sont sensibles à l'humidité ambiante dans la pièce. Les blocs doivent donc être stockés dans un dessiccateur.
13. Sectionnement sol produit des sections plus grandes entre 20-50 micromètres d'épaisseur. Il est utile pour l'analyse de fluorochrome (voir la section ci-dessous) en tant que sections plus épaisses de produire plus lumineux de fluorescence. Fixez la lame de diamant pour macrotome. Ajouter lubrifiant, tel que l'essence de pétrole au réservoir sur le macrotome. Fixez le bloc de la pince et d'orienter à la lame. Autoriser broyage pour produire lentement (environ 20-30 minutes par section) assurer une lubrification adéquate. La première section expose la face de coupe et oriente la section-elle doit être jetée.
14. La section suivante est alors placé sur une lame Superfrost Plus. La section a tendance à s'enrouler afin que nous vous recommandons de placer une partie d'un sac à sandwich sur elle puis le tenant à plat avec une autre lame serré en place. Il est ensuite placé dans un incubateur de 60-80 degrés Celsius pendant 1 heure. Cela adoucit le méthacrylate et contribue à la section adhérer à la lame de façon à plat.
15. La section du sol peut être nettoyé et poli comme l'exige l'aide de papier de verre fin en douceur.
16. Le microtome luge coupes fines sections, qui fournit les meilleures sections pour microsocopy lumière. Utiliser un microtome luge comme il l'a ajouté la rigidité, ce qui est requis pour la coupe de ces blocs durs. Alternativement un microtome alimenté rotatif peut être utilisé. Utilisez une lame en acier inoxydable de forte. Il est préférable d'avoir deux lames disponible en tant que l'on peut être aiguisée que l'autre est utilisé. La lame doit faire un angle de 45 degrés avec le bloc. Suadoucissant rface peut être réalisé en appliquant un papier humide sur le bloc si nécessaire. Cela peut prendre plusieurs sections à réaliser les conditions de coupe désirée pour obtenir une section de qualité. La section est alors flotté sur un bain d'eau et placé sur une lame comme dans 16 ci-dessus.
17. Réactifs de coloration sont énumérés dans des matériaux ci-dessous. Les protocoles sont basés sur ⁴ Bancroft et al. En raison de la variation d'épaisseur, il est recommandé d'optimiser les taches sur les lames de test. Coloration rack peut causer des tissus de flotter hors de la diapositive pour ajouter des taches directement à une diapositive plat peut être nécessaire. Un protocole identique ou coloration rack est nécessaire pour des résultats cohérents coloration requis pour histomorphométrie.
    1. Hématoxyline-éosine
       1. Colorer à Haematoxyilin 5-10 minutes
       2. Laver abondamment à l'eau du robinet Scott s
       3. Tache à l'éosine 5 minutes
       4. Laver à l'eau du robinet
       5. Clarifier dans le xylène
       6. Mont
       7. Résultats
          1. Ostéoïde = rose
          2. Os calcifié = brun violacé
          3. Noyaux = bleu
    2. Von Kossa
       1. Placez dans une solution de nitrate d'argent et d'exposer à une forte lumière jusqu'au os minéralisé devient noir (environ 10 mn)
       2. Laver à l'eau distillée trois fois
       3. Menace au thiosulfate de sodium pendant 5 minutes
       4. Laver à l'eau distillée
       5. Contre Safrinin avec O
       6. Clarifier dans le xylène
       7. Mont
       8. Résultats
          1. Osseuse minéralisée = noir
          2. Ostéoïde = rouge / rose
    3. Masson Goldner s Trichrome
       1. Laver à l'alcool alcalin (90mls d'éthanol à 80% et d'ammoniac 10mls 25% pendant 20 minutes)
       2. Rincer à l'eau
       3. Rincer à l'eau distillée
       4. Colorer à l'hématoxyline de Weigert s pendant 10 minutes
       5. Rincer à l'eau distillée
       6. Colorer à Ponceau-fuchsine solution finale 5 minutes
       7. Rincer avec de l'acide acétique à 1% 15 secondes
       8. Colorer dans acide phosphomolybdique-Solution orange G 5 minutes
       9. Rincer avec de l'acide acétique à 1% 15 secondes
       10. Tache de lumière verte 5 minutes
       11. Rincer avec de l'acide acétique à 1% 3 changements
       12. Rincer à l'eau distillée
       13. Mont
       14. Résultats
           1. Osseuse minéralisée = vert
           2. Ostéoïde = rouge / orange
           3. Les noyaux gris bleu =
           4. Cartilage = violet
18. Les préparations fluorochrome:
19. Ce sont administrés par injection intraveineuse lente, au moins deux semaines d'intervalle.
20. Doses
    1. Calcéine vert 10 mg / kg IV
    2. Oxytétracycline 50 mg / kg IV
    3. Alizarine complexone 30 mg / kg IV
21. Préparation de calcéine verte
    1. Un gramme de calcéine vert est titré avec NaOH 1 M jusqu'à dissolution.
    2. pH est ajusté avec NaOH à 1% jusqu'à pH = 7.1 au 7.2.
    3. Filtre et de garder à l'abri de la lumière
22. Préparation de Alizarine complexone
    1. Trois grammes de Alizarine complexone est titré avec NaOH 1 M jusqu'à dissolution.
    2. pH est ensuite ajusté à 1% HCl ou NaOH jusqu'à pH = 7.1 à 7.2.
    3. Filtre et de garder à l'abri de la lumière
23. Préparation de l'oxytétracycline
    1. L'oxytétracycline est disponible comme sur l'étagère de médicaments anti-microbiens. Aucune préparation n'est nécessaire.

Matériaux

a) Solution Hemotoxylin
Hemotoxylin	1g
Alcool absolu	100mL
b) Solution de fer
Aqueuse à 30% de chlorure ferrique	4mL
L'acide chlorhydrique (concentré)	1ml
Eau distillée	95ml

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine	0,75 g
fuchsion l'acide	0.25g
Acide acétique	1ml
mélanger l'eau, et ajouter distillée (100 ml)
b) une solution azophloxin
Azophloxin	0.5g
L'acide acétique	0.6ml
mélanger l'eau, et ajouter distillée (100 ml)
c) travail final solution de coloration
Ponceau-solution de fuchsine	5-10ml
Azophloxin	2mL
0,2% de solution d'acide acétique	88mL

Green Light	1g
l'acide acétique	1ml
Mélanger et ajouter de l'eau distillée (500 ml)

L'acide phosphomolybdique	3g
Orange G	2g
Dissoudre dans 500 ml d'eau distillée et ajouter le thymol cristal.

1% de nitrate d'argent aqueuse

Thiosulfate de sodium à 2,5%

1% de safranine O

Bleu Alcian 8GX	1g
3% de solution d'acide acétique	100mL

a) de Harris hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
L'alcool absolu	25mL
Alun de potassium	50g
l'eau distillée	500mL
l'oxyde de mercure	1,25 g OU
Iodate de sodium	0.5g
L'acide acétique glacial	20mL
b) une solution d'éosine
Eosine produit commercialement a été utilisé.

Fabricant	Fluorochrome	Numéro de catalogue
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcéine verte	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarine complexone	A3882
Intervet Australie, Victoria	Oxytétracycline (Hors médicaments antimicrobiens étagères)	Nom commercial; Engemycin 100