La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer

1. Sélection et le clonage de séquences conservées pour les tests

1. Il faut d'abord identifier le potentiel des séquences de régulation pour les tests fonctionnels. Nous comptons sur la conservation séquence évolutive comme un critère pour sélectionner les séquences, et le plus souvent recours à l'algorithme de PhastCons, qui est accessible comme une piste sur le navigateur du génome UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Cependant, il existe de nombreux autres algorithmes disponibles pour évaluer conservation de séquence entre les espèces.
2. Une fois que nous avons sélectionné nos séquences, nous concevoir des amorces pour amplifier chaque séquence de l'ADN génomique. Amorces devraient être choisis pour amplifier la région conservée plus 30 ou plus de paires de base de chaque côté.
3. Pour l'amplification des séquences sélectionnées, nous utilisons le Takara LA TaqTM système. Polymérases D'autres travaux, mais il est important d'utiliser un mélange qui comprend une enzyme avec une capacité de relecture, de minimiser les chances d'erreurs introduites lors de l'amplification. Nous vérifions la taille de l'amplicon par électrophorèse sur gel.
4. Nous utilisons la PCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) pour cloner le produit de la PCR dans un vecteur d'entrée contenant des sites de recombinaison attL, pour générer le clone d'entrée de passerelle. La réaction de clonage est plus efficace avec la PCR produit frais, il est donc préférable d'effectuer le clonage dans un jour de la PCR. Transformation dans des souches DH5a est effectuée suivie par la sélection de résistance à la spectinomycine.
5. Nous vérifions le produit du clonage TA par digestion de ~ 500 ng de plasmide avec EcoRI pour libérer l'insert, et de confirmer la taille de l'insert en gel d'agarose. Nous avons recommandé séquençage de vérifier la séquence d'insertion et d'orientation; amorces utilisées pour l'amplification peut également être utilisé pour le séquençage.
6. Depuis le clone d'entrée, la séquence non-codante conservé est la navette par recombinaison LR à notre vecteur de destination Passerelle prêt, pGW_cfosGFP1, en utilisant la passerelle LR Clonase II enzyme Mix (Invitrogen). Transformation dans des souches DH5a est effectuée suivie par la sélection de résistance à l'ampicilline.
7. Nous vérifions le produit de la recombinaison LR par digestion de ~ 500 ng de plasmide par EcoRV pour libérer l'insert, et de confirmer la taille de l'insert en gel d'agarose. Une fois un clone exact a été identifié, nous préparons l'ADN plasmidique en utilisant les HiSpeed ​​Qiagen ® Kit Plasmid Midi. Nous purifier davantage le plasmide en utilisant le kit QIAquick PCR Purification, conformément aux protocoles du fabricant, et éluer l'ADN avec de l'eau 30 uL RNase. Le plasmide est dilué à une concentration de 125 ng / uL et conservés à 4 ° C avant les injections.
8. ARN codant la transposase fonctionnelle Tol2 enzyme est transcrit in vitro à partir de la pDB600 plasmid2. Nous purifions le plasmide en utilisant le kit Qiagen Midi-Prep Kit, puis linéariser 10-20 mg par XbaI. La synthèse de l'ARNm est effectué suivant le protocole mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion).
9. Nous purifions et précipiter les ARN conformément aux instructions du kit. Nous resuspendre ARN à une concentration finale de ~ 1μg/μl, ou 20 pl pour une seule réaction, dans la RNase eau libre, et de quantifier par spectrophotométrie UV. Nous analysons aussi ~ 1 pg d'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose pour vérifier la transcription de pleine longueur. Bien qu'un TAE standard ou TBE gel est suffisante pour cette analyse, le tampon d'échantillon dénaturant inclus avec le kit de transcription doit être utilisé conformément aux instructions du kit.
10. Nous testons chaque nouveau lot de transposase ARN pour l'efficacité en effectuant des injections avec un plasmide connue (figure 1). Après vérification, l'ARN est divisée en petites aliquotes et conservés à -80 ° C, pour éviter la fonte et le regel répétés d'aliquotes individuelles.
    
    Figure 1. Embryon de poisson zèbre injecté avec l'amplificateur de souris Sox10 comme un contrôle. (Top) image Brightfield (Bas) fluorescence de la GFP image. Chaque nouveau lot de transposase ARN est testé pour son efficacité.

2. Microinjection d'embryons de poissons zèbres transgéniques pour l'analyse des mosaïques

1. Nous tirons les aiguilles pour la microinjection de 1,2 mm de verre à filament OD capillaire sur une Sutter P-97 Extracteur Micropipette, avec un programme conçu pour donner un pourboire forte avec un cône assez forte pour pénétrer chorions intacte. Nous brisons les conseils à la main sous un stéréomicroscope à un diamètre extérieur d'environ 15 um, en utilisant une lame de rasoir propre et d'un micromètre. Les aiguilles peuvent être faites la veille des injections, et stockés dans un plat recouvert tenant à garder propre.
2. Nous maintenons notre poisson zèbre sur un cycle régulier sombre lumière, avec 14 heures de lumière, sous conditions3 standard. La veille de microinjections de la scène, nous avons mis en place pour les poissons dans des réservoirs accouplements chronométré petit élevage, chacun constitué d'un réservoir de base, un insert fendu, et un couvercle en plastique. Nous mettons trois femelles ou deux mâles par tank en rangées parallèles.
3. Le matin de l'microinjections, peu après le cycle de lumière commence, nous commençons à combiner les mâles et les femelles de nettoyer le système d'eau traitée pour la production d'œufs. Il est important de vérifier sur le poisson fréquemment, et ramasser les oeufs en quelques minutes de pose, pour obtenir des lots bien synchronisés. La production d'œufs peut être maintenue pendant deux à trois heures, en continuant à combiner de nouveaux groupes de poissons pendant toute la matinée.
4. Avec un alésage de large, 5 1 / 4 "pipette Pasteur en verre équipé d'une ampoule au latex, nous trier les embryons prélevés en 60 x 15 mm boîte de Pétri, partiellement rempli d'embryon Medium2, par groupes de 50 embryons, et marquer le temps collectées sur le couvercle de chaque plat.
5. Une fois que les poissons ont commencé à jeter, nous préparons une solution nouvelle injection en mélangeant dans un tube de micro sur la glace:

   Composante
   Transposon stock de plasmide (125ng/μl)	1 microlitre
   Transposase ARN stock (175ng/μl)	1 microlitre
   Phénol stock de rouge (2% en H 2 O)	0.5μl
   RNase l'eau	2.5μl

   
   Les aiguilles d'injection sont pondus dans la tenue des plats et rempli par pipetage 500 gouttes de solution nl injection sur l'extrémité large de chaque aiguille. Après que le liquide est tiré de la pointe par capillarité, la solution supplémentaire peut être ajouté à un total de 1,5-2 ul. Nous préparer au moins deux aiguilles d'injection pour chaque solution.
6. L'aiguille remplie est chargé dans la main l'aiguille titulaire d'un pneumatique Pico-pompe ou une pression similaire injecteur, configuré et relié à un réservoir N2 selon les instructions du fabricant. Nous calibrer les volumes d'injection en mesurant le diamètre des gouttelettes expulsées dans l'huile minérale sur une lame micromètre. Typiquement, un temps d'injection de 120 ms avec une pression de 20 psi donnera une goutte d'environ 1 nl, mais de légères variations dans l'aiguille de diamètre aura une incidence sur ces paramètres et recalibrage peut être nécessaire entre les aiguilles.
7. Les injections sont réalisées sous un stéréomicroscope à 6-10X grossissement. Nous utilisons une paire de pinces fines pour tenir l'embryon en place, pousser l'aiguille d'injection avec une pression constante à travers le chorion et dans le jaune d'un embryon à la cellule une ou deux étapes au début de cellule. Idéalement, nous la position de l'aiguille dans le jaune juste en dessous des blastomères. Environ 1 nl d'une solution d'injection est expulsé et l'aiguille retirée. Pour chaque construction nous injectons ≥ 200 embryons. Il est également très important, pour chaque embrayage d'embryons collectés, pour sauver un plat d'embryons de contrôle non-injecté.
8. Après les injections sont terminées, nous trier les embryons en supprimant les œufs non fécondés, les embryons endommagés, et les injections ont échoué (embryons sans rouge de phénol dans les blastomères). Nous avons ensuite incuber les embryons dans le milieu de l'embryon à 28,5 ° C jusqu'au moment approprié pour les observations.

3. L'analyse des profils d'expression de mosaïque

1. Après un temps d'incubation approprié, nous examinons les embryons injectés pour la fluorescence. Le calendrier dépend du modèle d'expression normale du gène de poisson zèbre endogène, mais nous regardent habituellement quotidien à travers les 5 premiers jours après la fécondation.
2. Nous examinons les embryons pour la fluorescence sur un macroscope Olympus MVX10 équipé d'épifluorescence, mais n'importe quel microscope similaire capable d'imagerie de faible puissance de travail. Si il ya un grand nombre d'embryons qui sont morts ou développés de façon anormale dans la première journée, regardez les contrôles non-injecté pour cela d'embrayage pour voir si ils semblent normaux. Si les contrôles semblent normaux, le problème le plus fréquent est la pureté insuffisante de l'ADN injecté. En outre, les embryons à des stades précoces sont sensibles à la quantité totale de plasmide injecté, il est donc possible que la quantification était inexacte et trop de l'ADN a été injecté.
3. Lors de l'examen des embryons, gardez à l'esprit qu'ils seront tous mosaïque pour la construction d'injection. Il sera nécessaire d'examiner attentivement tous les embryons, surtout si le domaine de l'expression attendue est faible. Rappelez-vous aussi que l'expression pouvait être dynamique, forte fluorescence le jour 1 pourrait disparaître d'ici deux jours, et les embryons négatives pour l'expression des 3 premiers jours pourraient montrer quelque chose le jour 4.
4. Nous choisissons des embryons avec une expression plus large, et d'utiliser ces documents pour le modèle de la fluorescence par photomicroscopie. Après 5 jours d'observations, les embryons doivent être retournés à l'établissement et a grandi comme un stock. En quelques mois, les adultes peuvent être criblés pour la transmission de la lignée germinale du transgène.

4. Résultats

Nous voyons un grand Variété des modèles et des niveaux d'expression, en fonction de l'élément amplificateur en cours d'analyse. Nous sommes généralement intéressés par les modèles d'expression tissu très spécifiques, et sont souvent en se concentrant sur les gènes exprimés dans le squelette. et sont souvent en se concentrant sur les gènes exprimés dans le squelette. La figure 2 montre des exemples de profils d'expression de mosaïque, nous avons observé dans nos embryons injectés avec exhausteurs de régulation de l'expression dans le cartilage et les os. Enfin, une partie substantielle des séquences testées ne régulent l'expression tissu spécifique. Pour ces derniers, nous avons le plus souvent voir de fluorescence très peu, peut-être quelques cellules disséminées par embryon. Moins souvent, nous pourrions voir la fluorescence, mais seulement dans deux sites communs pour l'expression ectopique, l'épiderme et le muscle squelettique (figure 3).

Figure 2. Exemple de profils d'expression du cartilage et des os observés dans les embryons injectés.

Figure 3. Il ya peu de corrélation entre l'emplacement de l'enhancer relatives au gène et de régulation de l'expression. Une partie importante des séquences testées ne régulent l'expression tissu spécifique. Il s'agit souvent de fluorescence ont très peu, ou peut avoir deux sites communs d'expression ectopique: l'épiderme et le muscle squelettique. (Haut) l'image en fond clair (bas) image de fluorescence GFP.

We have demonstrated the approach used in our laboratory for the efficient analysis of potential enhancers using zebrafish transgenesis. Most often, we use this approach to look for tissue-specific enhancers associated with human genes. Despite the lack of obvious sequence homology most of the time between human and fish non-coding sequences, we find that this approach is usually successful in identifying enhancers for the genes of interest to us. The critical factors for success are taking care in the preparation of the plasmid DNA and the transposase RNA, and injecting and examining a sufficient number of embryos for each construct. The general methods of transgene construction, embryo microinjections, and mosaic expression analysis would be applicable to generating transgenic zebrafish lines for many other purposes.