La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer

Résumé

Nous démontrons notre approche pour trouver des éléments potentiels de gènes enhancer régulés par le développement et l'évaluation de leur fonction par transgenèse poisson zèbre mosaïque.

Résumé

L'achèvement du séquençage du génome humain, ainsi que de nombreuses autres espèces, a souligné le défi d'attribuer une fonction spécifique à séquences non codantes. Une fonction importante réalisée par la fraction non codante du génome est de réguler la transcription des gènes, mais il n'existe pas de méthodes efficaces pour prédire les gros éléments cis-régulateurs de la séquence d'ADN primaire. Nous avons développé un protocole efficace pour évaluer le potentiel fonctionnel éléments cis-régulateurs par transgenèse poisson zèbre. Notre approche offre des avantages significatifs sur culture cellulaire des techniques basées sur les gènes de développement importante, car elle fournit des informations sur la régulation des gènes spatiale et temporelle. Inversement, il est plus rapide et moins coûteux que des expériences similaires chez les souris transgéniques, et nous avons l'habitude de l'appliquer à des séquences isolées à partir du génome humain. Ici nous démontrons notre approche de sélection des éléments pour le test basé sur la conservation de séquence et de notre protocole de clonage de séquences et les micro-injection dans des embryons de poisson zèbre.

Protocole

1. Sélection et le clonage de séquences conservées pour les tests

1. Il faut d'abord identifier le potentiel des séquences de régulation pour les tests fonctionnels. Nous comptons sur la conservation séquence évolutive comme un critère pour sélectionner les séquences, et le plus souvent recours à l'algorithme de PhastCons, qui est accessible comme une piste sur le navigateur du génome UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Cependant, il existe de nombreux autres algorithmes disponibles pour évaluer conservation de séquence entre les espèces.
2. Une fois que nous avons sélectionné nos séquences, nous concevoir des amorces pour amplifier chaque....

Discussion

Nous avons démontré l'approche utilisée dans notre laboratoire pour l'analyse efficace des exhausteurs potentiels en utilisant la transgénèse poisson zèbre. Le plus souvent, nous utilisons cette approche pour chercher tissu-spécifique exhausteurs associées à des gènes humains. Malgré le manque d'homologie de séquence évidente la plupart du temps entre les humains et les poissons des séquences non codantes, nous constatons que cette approche est généralement réussi à identifier pour les exhausteurs de gènes d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
Kit de clonage pCR8/GW/TOPO TA	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen	11791-100
Cellules compétentes de haute efficacité de bibliothèque DH5α	Invitrogen	12535-019
Cellules compétentes de haute efficacité de bibliothèque DB3.1	Invitrogen	11782-018
Kit mMESSAGE mMACHINE	Ambion	AM1340
Kit HiSpeed Plasmid Midi	Qiagen	12643
Kit de purification QIAquick PCR	Qiagen	28104
Tireuse de micropipettes Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Pompe pneumatique PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820