Préparation des Courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de l'anticorps

Résumé

Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer Drosophile Chromosomes polytènes pour l'étiquetage des anticorps.

Résumé

Drosophile a longtemps été un modèle de système de prédilection pour étudier la relation entre la structure de la chromatine et la régulation des gènes en raison des avantages cytologique fournie par le géant de chromosomes polytènes salivaires des glandes du stade larvaire tiers. Dans ce tissu les chromosomes subissent de nombreux cycles de réplication, en l'absence de la division cellulaire donnant naissance à environ 1000 exemplaires. L'ADN reste alignée après chaque cycle réplicatif résultant dans des chromosomes fortement agrandie qui fournissent une occasion unique de mettre en corrélation la morphologie chromatine avec la localisation des protéines spécifiques. En conséquence, il a été un haut niveau d'intérêt dans la définition des modifications épigénétiques présents à des gènes différents et à différentes étapes du processus de transcription. Un outil important pour de telles études est l'étiquetage des chromosomes polytènes avec des anticorps à l'enzyme, facteur de transcription, ou la modification des histones d'intérêt. Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer la drosophile chromosomes polytènes pour l'étiquetage des anticorps.

Protocole

Le protocole suivant pour la préparation des chromosomes polytènes de squash est adaptée de la procédure décrite dans Johansen et al. (2009).

1. Culture de larves de drosophile troisième stade

Afin d'obtenir optimale chromosomes polytènes de haute qualité des préparations de squash, des conditions de culture sont essentiels fréquentés (c'est à dire, placer environ 20 ponte des mouches femelles dans une norme de 4 bouteille volée "et changer pour une nouvelle bouteille chaque jour). Sélectionnez la plus grosse des individus de la première récolte de l'escalade troisième stade larvaire pendant qu....

Discussion

L'inclusion d'acides acétique et lactique dans les protocoles conventionnels de fixation facilite la résolution de squash et deux interbandes bras chromosomique propagation mais malheureusement, certains épitopes ne survivent pas à ce traitement. Un exemple d'un tel épitope est H3S10ph (Cai et al., 2008). Depuis traitement à l'acide a aussi l'inconvénient qu'il désaltère la fluorescence intrinsèque des protéines étiquetées GFP, DiMario et al. (2006) a récemment développé une bas.......