Les auteurs n’ont rien à divulguer.

christopher hughes: un modèle in vitro pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse (interview)

Christopher Hughes CW décrit l&#39;utilité de son système de culture pour étudier l&#39;angiogenèse in vitro. Il explique l&#39;importance des fibroblastes qui sécrètent une critique, encore non identifiés, facteur soluble qui permettent aux cellules endothéliales pour former des vaisseaux dans la culture de cette branche, la forme correcte lumens, et subissent anastomose.

Christopher Hughes: un modèle in vitro pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Bonjour, je m’appelle Dr. Christopher Hughes. Je suis professeur à l’Université de Californie à Irvine et mon laboratoire travaille sur l’angiogenèse. Et nous nous intéressons particulièrement aux gènes qui régulent le processus d’angiogenèse.Nous avons optimisé un essai in vitro basé sur les travaux de Nelson et, et dans ce test, nous pouvons examiner tous les différents processus qui se déroulent pendant l’angiogenèse, nous enrobons des billes de tedex, de petites billes avec des cellules endothéliales. Ensuite, nous les intégrons dans des gels de fibrine. Nous fournissons des facteurs de croissance.Et au cours de plusieurs jours, les cellules endothéliales poussent à partir des billes. Ils migrent, ils s’alignent, ils prolifèrent, ils font des tubes, ils se ramifient et ils forment des anastomoses. De sorte qu’au bout de 10 jours environ, nous avons un capillaire complet comme un réseau dans la culture.Eh bien, certains des problèmes avec les tests d’envivo et d’angiogenèse, par exemple, ceux qui sont faits chez la souris, c’est qu’il n’est pas très facile de manipuler le système. C’est difficile à visualiser quand vous avez cela à l’intérieur d’un animal, vous, vous ne pouvez pas vraiment voir l’angiogenèse se produire. Et si vous voulez manipuler le système dans nos cultures in vitro, il est très facile de manipuler génétiquement les cellules endothéliales, d’activer et de désactiver les gènes, et d’examiner les effets de cela sur l’angiogenèse germinative.Et c’est beaucoup plus difficile de faire cela chez l’animal entier. Vous devez faire des KO ou des knock-ins. Ce sont donc les deux principaux avantages.C’est, c’est facile à manipuler et c’est facile à visualiser. Ainsi, au fil des ans, il y a eu un certain nombre de tests d’agénésie in vitro différents développés et ils ont tous leurs avantages et leurs inconvénients. Et en particulier, un bien connu est le test de gel matriciel, où les cellules endothéliales sont placées au-dessus de cette matrice extracellulaire appelée matrigel.Et le problème, c’est que les cellules endothéliales forment des structures semblables à des cordes, mais elles ne font jamais vraiment de vaisseaux aluminisés. Vous ne voyez pas de germination, vous ne voyez pas d’anastomose. Il existe des modèles de gel de collagène, qui peuvent être bons.Il y en a beaucoup Vous ne voyez pas la prolifération des cellules endothéliales. Vous n’avez pas tendance à voir une anastomose. Le test de gel de fibrine que nous avons développé est basé sur un modèle de Nelson Kar publié au milieu des années quatre-vingt-dix.Et nous l’avons maintenant considérablement amélioré, de sorte que nous pouvons voir toutes les étapes de l’angiogenèse. Nous pouvons observer la germination initiale, la migration. Nous assistons à la prolifération des cellules, à la formation de lumières, à la ramification et enfin à l’anastomose pour former un réseau vasculaire complet in vitro.Donc, ce test est vraiment, nous pensons que le, le meilleur système in vitro qui existe si vous voulez examiner toutes ces différentes étapes de l’angiogenèse. Un autre avantage que nous avons avec ce test in vitro est que nous pouvons faire de la capture laser, de la microdissection, nous pouvons faire tourner la culture pour qu’elle devienne très plate, puis utiliser le microscope de micro-dissection à capture laser. Nous pouvons en fait retirer des cellules individuelles et en particulier nous nous intéressons aux cellules de pointe.Nous les éliminons donc et nous pouvons examiner l’expression des gènes, en particulier dans les cellules de l’extrémité par rapport aux cellules du tronc, les cellules qui fabriquent réellement la lumière. Et notre hypothèse est qu’il y aura une expression génique différentielle entre ces deux populations de cellules. Nous pouvons regarder cela, il serait pratiquement impossible de le faire dans un système in vivo.Nous pensons donc que c’est un autre avantage majeur de l’utilisation de ce test in vitro. Les premiers travaux qui ont été faits dans ce domaine, comme je l’ai mentionné par Nelson Recon, ont utilisé des cellules endothéliales microvasculaires. Et on pense beaucoup que les cellules endothéliales microvasculaires, les cellules que vous voudriez utiliser pour un test comme celui-ci, parce qu’in vivo, c’est l’EC microvasculaire qui forme vraiment de nouveaux vaisseaux.Nous avons décidé d’essayer de le faire avec ve. Ce sont des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine pour plusieurs raisons. L’une d’entre elles est que ces cellules sont très faciles à obtenir.Vous pouvez aller à l’hôpital, vous pouvez obtenir des cordons ombilicaux dans les salles d’accouchement et vous pouvez isoler les cellules très facilement. Et ces cellules sont également utilisées en culture depuis de nombreuses années. Ils sont très bien caractérisés.Nous avons donc mis en place ce test et l’avons optimisé afin de pouvoir utiliser ces cellules pour ces raisons. Et fait intéressant, il s’avère que vex, ces cellules endothéliales de gros vaisseaux semblent prendre la forme de cellules endothéliales microvasculaires et de culture. Ils perdent beaucoup de gènes qui sont normalement exprimés par les gros vaisseaux ec et ils commencent à exprimer des gènes qui sont normalement associés aux cellules endothéliales microvasculaires.Et ils sont parfaitement capables de former des capillaires comme des pousses, de faire des lumens et de faire ressembler ce que le monde entier est à de véritables capillaires dans la culture. Ils sont donc faciles à utiliser, ils sont faciles à utiliser et ils font ce que nous voulons qu’ils fassent. Ils germent et ils font de véritables récipients aluminisés.Lorsque nous voulons quantifier ce test, il y a vraiment plusieurs façons de procéder. On peut s’intéresser à des critères vraiment quantitatifs tels que le nombre de pousses, la longueur des pousses, le diamètre des pousses, le nombre de points de branche, le nombre d’anastomoses, mais on regarde aussi des critères qualitatifs. Et nous pouvons donc regarder s’ils forment des lumens ?Et c’est probablement ce qui nous intéresse le plus. Dans beaucoup de tests que nous faisons, il y a leur formation correcte de lumière. Et il s’agit plutôt d’une évaluation qualitative, bien qu’à mesure que les vaisseaux s’agrandissent, on peut également mesurer le diamètre de ces lumens.Nous utilisons donc des fibroblastes dans ces cultures. Nous intégrons les billes dans le gel de fibrine et nous plaçons des fibroblastes sur le gel. Les fibroblastes sont absolument essentiels à la bonne germination et à la formation de la lumière.En l’absence de fibroblastes, nous obtenons une certaine germination. Cependant, les cellules endothéliales ont tendance à ne pas rester attachées les unes aux autres. Ce qui se passe, c’est qu’ils migrent loin l’un de l’autre.Et donc, toute structure que vous développez sur cette pousse a tendance à s’effondrer. Et après quelques jours, les cellules endothéliales subissent l’apoptose. Il semble donc que les fibroblastes fabriquent des facteurs essentiels à l’angiogenèse, du moins dans ce système in vitro.Et nous avons été très intéressés à savoir quels sont ces facteurs. Ce que nous avons découvert, c’est que les fibroblastes sécrètent quelque chose dans le milieu, de sorte que nous pouvons prendre un milieu de condition à partir des fibroblastes et qui favorisera une germination et une formation de lumière appropriées. Il s’agit donc certainement d’un facteur soluble.Donc, évidemment, nous sommes très intéressés de savoir ce que les fibroblastes produisent qui est si important pour l’angiogenèse dans ce système. Nous avons essayé tous les suspects habituels, le VEGF, le fg F de base sont, sont dans la culture, l’ajout de plus ne remplace pas les fibroblastes. Nous avons également essayé l’angiopoïétine un, le TGF bêta, le H, le GF, etc., etc.Jusqu’à présent, nous n’avons pas trouvé le facteur vital. Donc, ce que nous faisons maintenant, c’est purifier les facteurs de la maladie des fibroblastes. Nous plaçons donc le milieu de condition sur diverses colonnes, cations, échanges, exclusions de taille, et nous obtenons des fractions de cela qui ont de l’activité.Et nous suivons maintenant cette activité et nous prenons ces fractions, trouvons celles qui sont actives, et à partir de là, nous pouvons les exécuter sur des gels, nous assurer que nous avons juste un, un nombre relativement faible de bandes sur le gel, puis nous pouvons les découper et les séquencer par spécification de masse. Et, et cela nous donne beaucoup de jours intéressants. Nous avons maintenant un certain nombre de gènes candidats que nous testons individuellement pour voir s’ils sont réellement le facteur que nous recherchons.Nous avons donc testé un grand nombre de facteurs angiogéniques connus et nous savons que le GF végétal et le FGF de base sont en fait essentiels pour la bonne germination dans ce test. Mais ce n’est pas toute l’histoire. Il y a des facteurs dérivés qui sont importants, comme je l’ai mentionné, et l’une des façons dont nous avons examiné cela est que nous avons pris des cellules tumorales, qui sont hautement angiogéniques in vivo, elles génèrent de grandes tumeurs chez la souris et elles sont très vascularisées.Et nous avons examiné ces cellules tumorales et elles expriment des niveaux très élevés de vegf et nous les avons mises dans nos cultures. Nous avons donc substitué les fibroblastes avec ces cellules tumorales et elles ne soutiennent pas l’angiogenèse robuste dans ce test. Et ça, c’est très intéressant.Ce que cela suggère, et cela a également été suggéré par d’autres personnes, c’est qu’il y a une diaphonie entre la tumeur, le stroma S, c’est-à-dire les fibroblastes et d’autres cellules de soutien dans le tissu et les cellules endothéliales. Et il se pourrait bien que les cellules tumorales produisent certains facteurs qui agissent directement sur les cellules endothéliales, mais elles en produisent également d’autres qui stimulent les fibroblastes et d’autres cellules stromales à fabriquer des facteurs qui soutiennent également l’angiogenèse robuste.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

University of California, Irvine (UCI).  Christopher Hughes CW décrit l'utilité de son système de culture pour étudier l'angiogenèse in vitro. Il explique l'importance des fibroblastes qui sécrètent une critique, encore non identifiés, facteur soluble qui permettent aux cellules endothéliales pour former des vaisseaux dans la culture de cette branche, la forme correcte lumens, et subissent anastomose.

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