Article de méthode

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l'enregistrement Electroolfactogram Air-phase

DOI :

10.3791/1850

⸱

2 mars 2010

 ,  , 
1Biology, Johns Hopkins University

Dans cet article

Résumé

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Le electroolfactogram (EOG) l'enregistrement est une instructive, facile à réaliser et fiable d'évaluer la fonction olfactive au niveau de l'épithélium olfactif. Ce protocole décrit une configuration d'enregistrement, de préparation des tissus de la souris, la collecte de données et d'analyse des données de base.

Résumé

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Animaux dépendent pour beaucoup sur l'olfaction comportements critiques, telles que trouver des sources de nourriture, éviter les prédateurs, et l'identification des congénères pour l'accouplement et autres interactions sociales. Le electroolfactogram (EOG) est une méthode d'enregistrement informatif, facile à conduire, fiable et à la fonction olfactive de dosage au niveau de l'épithélium olfactif. Depuis la description de 1956 de l'EOG par Ottoson de grenouilles 1, l'enregistrement EOG a été appliquée dans de nombreux vertébrés, y compris les salamandres, les lapins, les rats, les souris et les humains (revu par Scott et Scott-Johnson, 2002, réf. 2). Les récents progrès dans la modification génétique sur les souris ont ravivé l'intérêt pour l'enregistrement de la EOG pour la caractérisation physiologique de la fonction olfactive de knock-out et souris knock-in. Enregistrements EOG ont été appliquées avec succès à démontrer le rôle central des composants olfactifs transduction du signal 3-8, et plus récemment pour caractériser la contribution de certains mécanismes de réglementation pour les réponses OSN 9-12.

Détection Odorant produit à la surface de l'épithélium olfactif sur les cils des ARS, où une cascade de transduction du signal conduit à l'ouverture de canaux ioniques, générant un courant qui circule dans les cils et dépolarise la membrane 13. L'EOG est le potentiel négatif enregistré extracellulaire à la surface de l'épithélium olfactif lors de la stimulation odorante, résultant d'une sommation des changements potentiels causés par les différents réactifs ARS dans le domaine de l'enregistrement 2. Comparaison de l'amplitude et la cinétique de l'EOG donc fournir de précieuses informations sur la façon dont la modification génétique et d'autres manipulations expérimentales influencent la signalisation moléculaire sous-jacente de la réponse aux odeurs OSN.

Nous décrivons ici un enregistrement EOG air de phase sur une préparation de cornets de souris olfactif. Brièvement, après avoir sacrifié la souris, les cornets olfactifs sont exposés par la bissectrice de la tête le long de la ligne médiane et en enlevant la cloison. La préparation du cornet est ensuite placé dans la configuration de l'enregistrement, et une électrode d'enregistrement est placé à la surface de l'épithélium olfactif sur l'un des cornets médial. Une électrode de référence est relié électriquement à travers le tissu d'une solution tampon. Un flux continu de l'air humidifié est soufflé sur la surface de l'épithélium pour le garder humide. La vapeur de solutions odorisant est soufflé dans le flux d'air humidifié pour stimuler l'épithélium. Les réponses sont enregistrées et numérisées pour une analyse ultérieure.

Protocole

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Partie 1. La configuration de l'enregistrement EOG

L'appareil d'enregistrement est constitué d'une électrode d'enregistrement, l'électrode de référence, le tube de distribution d'air, le stade de l'échantillon, et d'un microscope de dissection, tous ancrés sur une table d'air dans une cage de Faraday. Micromanipulateurs sont utilisés pour le placement des électrodes et le tube d'arrivée d'air. Un courant d'air continu est barboter dans l'eau distillée pour ajouter de l'humidité avant de passer par le tube d'arrivée d'air et plus l'échantillon. Une boîte de culture de 60 mm rempli de Sylgard à une profondeur de 6-8 mm est utilisée comme une surface de montage pour l'échantillon. Un puits et un canal sont creusées dans la Sylgard dans le plat de montage de fournir un moyen pour relier électriquement l'électrode de référence au modèle via la solution de Ringer modifiée.

L'électrode d'enregistrement et de l'électrode de référence sont connectés à un amplificateur. Les signaux de l'amplificateur sont envoyés à un numériseur, puis à un ordinateur. Des logiciels tels que Axograph ou pClamp peut être utilisé pour contrôler le protocole de stimulation, d'enregistrer le signal, et pour une analyse ultérieure des réponses. Un oscilloscope relié après l'amplificateur peut être pratique pour le suivi en temps réel du potentiel électrique en plaçant l'électrode d'enregistrement et pendant les enregistrements EOG.

La livraison des stimuli olfactifs est contrôlé par un Picospritzer, qui est connecté à l'ordinateur que celle utilisée pour l'acquisition du signal. La pression d'air à l'Picospritzer est fixé à 10 psi. Un réservoir d'air unique et régulateur peut être utilisé pour fournir de l'air à la fois à la table de l'air et l'Picospritzer. Un réservoir d'air seconde et régulateur est utilisé pour fournir de l'air pour le flux d'air humidifié, car cela nécessite une pression plus faible et une grande quantité d'air. Juste avant de livrer un stimulus odorant, la sortie Picospritzer est connecté à une bouteille odorant. La bouteille odorant est ensuite relié au tube de refoulement d'air.

Partie 2: Préparation des électrodes

L'électrode d'enregistrement est un fil d'argent chloruré dans un verre tiré capillaire rempli de solution de Ringer modifiée (135 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM d'HEPES, pH 7,4, stérilisée par filtration). L'électrode de référence est un fil d'argent chloruré.

  1. Installez fil d'argent dans le porte-électrode. Pour l'électrode d'enregistrement, un à deux centimètres du câble doit dépasser de la fin du porte-électrodes. Plus de fil peut être laissé pour l'électrode de référence.
  2. Pour ajouter la couche d'AgCl le fil d'argent, la position du fil dans 0,1 M de NaCl et connectez le porte-électrode à la borne positive d'une source de 1,5 à 9 V CC. La borne négative de la source d'alimentation doit être connecté électriquement à la solution 0,1 M de NaCl. Laisser la réaction de chloration de procéder pendant 10 minutes. Pour égaliser toute charge statique entre l'enregistrement et l'électrode de référence, brièvement les électrodes ensemble avant de les installer sur l'appareil d'enregistrement.
  3. Tirez un verre capillaire en utilisant un extracteur micropipette. L'ouverture à l'extrémité du capillaire doit être autour de 5-10 microns de diamètre.
  4. Utilisez un crayon de diamant pour marquer et casser l'extrémité émoussée du capillaire de sorte qu'il est ~ 2 cm de plus que le fil d'argent. Incendie-polonais à la fin couper avec la torche au butane.
  5. Faire fondre de 0,5% d'agarose dans une solution de Ringer modifiée. Tirez une petite quantité d'agarose solution fondue dans la pointe de l'électrode à l'aide d'une pipette de transfert.
  6. Remplir le capillaire tiré environ 1 / 2 de la voie avec une solution de Ringer modifiée (une seringue qui a été chauffé et a tiré à avoir une fin longue et mince est utile à cet effet). Tapotez doucement la capillarité pour déloger les bulles d'air. Magasin de l'électrode dans le bocal rempli de stockage avec une petite quantité de solution de Ringer modifiée dans le bas jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées. Une fois un échantillon de tissu est préparé et prêt pour l'enregistrement, l'installation d'un capillaire rempli sur le fil électrode d'enregistrement.

Partie 3: Préparation des solutions odorant

L'acétate d'amyle et odorants heptaldéhyde évoquent des réponses et des grands choix sont donc de bonnes comme des stimulants de EOG.

  1. En microtubes, préparer une série de dilutions de substance odorante dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Comme point de départ d'une courbe dose-réponse, préparer 10 dilutions de 5 m à 5 x 10 -6 M. Faire des dilutions fraîche chaque jour.
  2. Diluer les odorants de 50 fois dans de l'eau en mélangeant 100 uL d'actions dilué dans du DMSO à 4,9 ml dans l'eau 2 bouteilles avec des bouchons en silicone once. Laissez les solutions s'équilibrer dans les bouteilles pendant au moins 30 minutes. Notez que la concentration de vapeur d'odorants dans chaque bouteille est inconnue, mais peut varier en fonction de la concentration des molécules odorantes dans la phase liquide.
  3. Insérez deux aiguilles de calibre 18 à travers le bouchon de silicone à pournir entrée et de sortie. Les ports devraient être branché lorsque la bouteille n'est pas en usage.

Partie 4: Enregistrement des données et l'analyse de l'EOG

  1. Sacrifice d'une souris par le CO 2 d'euthanasie ou d'anesthésie surdose suivie par décapitation. Retirez la peau recouvrant le crâne et sagittalement coupent la tête le long de la ligne médiane.
  2. Montez une moitié de la tête, côté médial le haut, sur le plat de montage. Retirer délicatement le septum pour exposer les cornets.
  3. Placer le plat avec le tissu monté sur la scène d'enregistrement. Aligner la scène pour que l'emplacement d'enregistrement sur les cornets est centré sous le microscope.
  4. Mettez le réservoir d'air pour fournir de l'air humidifié à la surface du cornet. Placez le tube d'alimentation d'air de sorte qu'il est d'environ 10 mm de l'emplacement d'enregistrement. Le débit est de ~ 600 mL / min.
  5. Régler l'amplificateur à courant continu en mode (amplification AC va induire des artefacts dans le signal EOG) avec filtre passe-bas à 1 kHz, et le gain à 100x.
  6. D'enregistrement et de montage des électrodes de référence sur le micromanipulateurs.
  7. Basse l'électrode de référence dans le puits sur le plat de montage et couvrir avec une solution telle qu'elle est relié électriquement au tissu modifiés Ringer.
  8. Abaisser avec précaution l'électrode d'enregistrement sur la surface du cornet IIb ou III. L'électrode doit à peine toucher la surface de l'épithélium olfactif! Lorsque l'électrode est en contact avec l'épithélium (c'est à dire un circuit électrique) d'une ligne de base droite apparaîtra dans l'oscilloscope.
  9. Attacher un flacon odorant sur le port parallèle sur le tube d'arrivée d'air.
  10. Sur l'ordinateur, lancer un protocole de stimulation. Le taux d'échantillonnage pour l'acquisition de données devrait être de 2 kHz ou plus. Le logiciel va déclencher une impulsion odeur et commencer l'enregistrement.
  11. Un protocole de stimulation typique peut être une durée d'impulsion de 100 ms unique, jumelé de 100 msec impulsions séparées par un intervalle de 1 seconde, ou une impulsion de 10 sec soutenue.
  12. Laisser un peu de temps entre les protocoles de sorte que le tissu est peu adapté. Une minute suffit pour les concentrations de liquide de l'acétate d'amyle et heptaldéhyde jusqu'à 10 -3 M; à des concentrations élevées permettre 5 minutes. Après avoir livré les concentrations de l'odeur forte (comme à la fin d'une courbe dose-réponse) d'odeur résiduelle peut rester dans le tube. Laver le tube d'air avec de l'éthanol à 95% et sec avant de continuer avec des échantillons de tissus supplémentaires.
  13. Axograph logiciel fournit des outils pour mesurer les principaux paramètres du signal EOG. Ces paramètres incluent l'amplitude de la réponse, la latence, le temps de pointe, et des constantes de temps de résiliation. Il peut être souhaitable de filtrer numériquement les traces à 25 Hz, avant une analyse plus poussée.

Les résultats représentatifs

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Figure 1. Paramètres pour EOG analyse. Plusieurs paramètres de l'EOG sont particulièrement utiles pour la comparaison des réponses entre les souris, y compris l'amplitude de la réponse, la latence (le temps entre le moment où le stimulus est administrée et la réponse commence), temps de montée (le temps entre le début de la réponse et la crête), le temps de pointe (le temps depuis le début de la stimulation à la pointe de la réponse), et la constante de temps de résiliation (τ, déterminées en ajustant la phase de décroissance de la réponse à une seule équation exponentielle ). Pour la comparaison des paramètres cinétiques tels que la latence, temps de montée, et la constante de temps de résiliation, il est conseillé de normaliser l'amplitude du pic des réponses avant l'analyse.

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Figure 2. Représentant EOG signaux sous différents protocoles de stimulation. (A) Exemples de EOGs d'une souris en réponse à une stimulation par des concentrations croissantes de l'acétate d'amyle. La ligne noire en haut du panneau indique la date et la durée de la stimulation odorante. Les concentrations dans la légende sont les concentrations de la solution liquide. (B) Une relation dose-réponse en moyenne de cinq souris. Les barres d'erreur sont les intervalles de confiance à 95%. Une baisse de l'amplitude du pic est souvent observé à des concentrations d'odeur très forte. (C) Un exemple d'EOG en réponse à une stimulation double choc. Une seule impulsion courte odorant provoque l'adaptation durables pendant plusieurs secondes. (D) Un exemple d'EOG en réponse à un 10-sec de la stimulation odorante. L'EOG montre désensibilisation lors de la présentation odorant continue.

Discussion

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Avec la configuration décrite dans ce protocole, les stimuli olfactifs à la surface de l'épithélium olfactif sera compatible entre les préparations des tissus, permettant une comparaison entre le type sauvage et des souris mutantes, même si la concentration odorante exacte et la dynamique sont inconnus. Plusieurs facteurs, notamment l'emplacement d'enregistrement et le débit d'air humidifié, provoquent des variations de l'EOG. Il faut prendre soin d'enregistrer à partir des positions similaires sur le même cornet pour minimiser les variations. Cela peut facilement être réalisée par le l'enregistrement à partir du même côté de la tête et en gardant l'empreinte du microscope, le tube de livraison odeur, et micromanipulateurs sur la table de l'air stable entre des échantillons de tissus. En outre, des échantillons de tissus devraient être immédiatement placés dans le flux d'air humidifié après la dissection afin d'éviter un séchage excessif des tissus.

Enregistrements EOG sur les souris peuvent également être réalisées avec un appareil de perfusion du liquide sur la souris préparées cornets 7, 14, 15, ou en laissant la tête intacte et l'insertion de l'électrode dans un petit trou percé au-dessus des 16 cornets, 17. Chaque variation de l'enregistrement EOG a ses propres forces: air-phase des enregistrements sur des préparations de tissus tels que décrits dans ce protocole nécessite une quantité minime de configuration et sont plus faciles à mener, des enregistrements en utilisant un appareil de perfusion de liquide de faciliter l'utilisation de réactifs pharmacologiques, bien que le nature hydrophobe des molécules odorantes de nombreux complique la livraison d'odeur, enfin, les enregistrements dans lesquels la tête est laissée intacte peut être utilisé en «artificiel renifler» les expériences, même si le placement des électrodes est plus difficile que lorsque les cornets sont totalement exposés.

Déclarations de divulgation

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Les souris ont été traitées et euthanasié aux méthodes approuvées par le soin des animaux et des comités Utilisation de l'Université Johns Hopkins.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Yijun Song, et les membres du Hattar Kuruvilla Zhao tri-laboratoire du Département de biologie, Université Johns Hopkins pour les conseils et l'aide. Soutenu par des subventions du NIH et de DC007395 DC009946.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipementtube de distribution d’airFabriqué surLe baril d’une seringue de 1 ml avec un raccord en T peut être utilisé comme équipement de table d’air de substitution
Newport Corp.Amplificateur LW3030B-OPT
ÉquipementWarner InstrumentsDP-301
Ordinateur et acquisition de donnéesÉquipement logiciel Axograph 4.9.2 sur Apple MacintoshDes versions mises à jour d’Axograph pour Mac OS X et Windows sont disponibles à partir de http://axographx.com/.
Équipementde torche au butaneA crè ; moi brû ; lè ; La torche fonctionne bien
Équipement numériseurAxon InstrumentsDigidata 1322A
Équipement de lunette de dissectionScienscopeSSZ
Équipementde porte-électrodeHarvard Apparatus64-1021
Dispositifs de maintien magnétique (12 mm)équipementWorld Precision Instruments, Inc.M10
World Precision Instruments, Inc.M3301R M3301L
Équipement d’extraction de micropipettesSutter Instrument Co.P2000
Tektronix, Inc.5110
Équipement Picospritzer IIIParker Hannifin Corporation
Équipement de tuyauterie en siliconeNalge Nunc international
Équipement de scène d’échantillonFabriqué surTout petit objet solide peut être utilisé pour élever le plat de montage. Immobilisez le plat avec de la pâte à modeler.
Matériau des aiguilles de calibre 18BD Biosciences305195
Matériau des bouteilles en verre de 2 ozVWR international16152-201
Matériaudes capillaires en verreWorld Precision Instruments, Inc.TW150F-6
Bouchons en silicone taille 16DmatériauChemwareD1069809
Matériau du fil d’argentWorld Precision Instruments, Inc.
Matériau SylGuard 184Dow CorningSYLG184de World Precision Instruments
Réactif d’agaroseInvitrogen15510-027
Réactif d’acétate d’amyleAldrichW504009
Chlorure de calcium (CaCl2)réactifSigma-AldrichC-1016
Réactif de diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD5879
Réactif HEPESFisher ScientificBP310
Réactifd’heptaldéhydeAldrichH2120
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2+6H2O)réactif Sigma-AldrichM9272
Réactif de chlorure de sodium (NaCl)JT Baker3624-05
équipementdébitmètreGilmont InstrumentsGF-2260
de mesure Équipement de micromanipulateurs Équipement d’oscilloscope mesure AGW1010 de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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