Cette vidéo montre le protocole d'un essai angiogenèse in vitro que les stades récapitule plusieurs de l'angiogenèse. Time-lapse images de la germination, la formation de lumière, la ramification et anastomose - caractéristiques essentielles de l'angiogenèse - sont présentés.
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Article de méthode
Optimisé fibrine billes de gel d'analyse pour l'étude de l'angiogenèse
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'angiogenèse est un complexe multi-étapes, où, en réponse aux stimuli angiogéniques, les nouveaux navires sont créés à partir de la vascularisation existante. Ces étapes comprennent: la dégradation de la membrane basale, la prolifération et la migration (germination) des cellules endothéliales (CE) dans la matrice extracellulaire, l'alignement de la CE en cordons, de branchement, la formation de lumière, anastomose, et la formation d'une nouvelle membrane basale. Beaucoup d'essais in vitro ont été développées pour étudier ce processus, mais la plupart ne reproduisent certaines étapes de l'angiogenèse, et morphologiquement les vaisseaux dans les dosages ne sont souvent pas ressembler à des navires in vivo. Basé sur des travaux antérieurs et Nehls Drenckhahn, nous avons optimisé un dosage de l'angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE et les fibroblastes. Ce modèle reprend toutes les étapes clés au début de l'angiogenèse et, surtout, les vaisseaux d'affichage des brevets lumens intercellulaire entouré par polarisée CE. CE sont enduites sur microporteurs Cytodex et intégrés dans un gel de fibrine. Les fibroblastes sont en couches sur le dessus du gel, où ils assurent nécessaires facteurs solubles qui favorisent la germination CE de la surface des billes. Après plusieurs jours, de nombreux navires sont actuellement qui peut facilement être observée sous contraste de phase et de la microscopie time-lapse. Cette vidéo montre les étapes clés à mettre en place ces cultures.
Protocole
CELLULES PRÉPARATION
- Amener HUVEC et des fibroblastes en M199/10% de FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 jours avant perles.
- Interrupteur à moyen et à EGM-2 (Clonetics) la veille pour le perlage HUVEC et le jour avant l'intégration des fibroblastes.
- Une concentration de ~ 400 billes par HUVEC est nécessaire.
- 20000 fibroblastes par puits est nécessaire.
REVÊTEMENT les billes avec HUVEC - Jour -1
- Trypsiniser HUVEC.
- Autoriser perles de régler (Ne pas centrifuger!). Aspirer le surnageant et laver les perles brièvement dans 1 ml d'eau tiède EGM-2 moyennes.
- Mix 2500 perles w / 1X10 6 HUVEC dans 1,5 ml d'eau tiède EGM-2 moyennes dans un tube FACS. Placez-le verticalement dans l'incubateur. (Ce sera suffisant pour ~ 10 puits. Intensifier si nécessaire)
- Incuber pendant 4 heures à 37 ° C, en agitant le tube toutes les 20 min. (Bon revêtement est cruciale pour la germination.)
- Après 4 heures, transférer l'billes revêtues d'un flacon de 5 ml de T25 dans EGM-2 et laissez O / N.
INCORPORER billes revêtues en fibrine GEL - JOUR 0
- Préparer la solution de fibrinogène 2,0 mg / ml (voir la section recette).
- Ajouter 0,15 unités / ml d'aprotinine pour la solution de fibrinogène.
- Transfert des billes revêtues d'un tube conique de 15 ml et laisser s'installer des perles. Remettre en suspension dans 1ml perles d'EGM-2 et le transfert d'un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- Laver les billes 3X avec 1mL d'EGM-2 par pipetage et lentement.
- Nombre des perles sur une lamelle et remettre en suspension dans une solution de fibrinogène à une concentration de ~ 500 billes / mL.
- Ajouter 0.625 unités / ml de thrombine à chaque puits.
- Ajouter 0,5 mL de la suspension du fibrinogène / bille dans chaque puits d'une plaque de 24 puits.
Changer l'embout de pipette pour chaque puits! - Mélanger la thrombine et le fibrinogène en allant de haut en bas doucement avec la pipette ~ 4 à 5 fois. Soyez prudent de ne pas faire de grosses bulles.
- Laisser la plaque pendant 5 min dans la hotte, puis le placer dans le 37 ° C-incubateur pendant 10-15 min pour générer un caillot.
- En attendant que le caillot, trypsiniser fibroblastes.
- Ajouter 1 mL d'EGM-2 par puits goutte à goutte.
- Fibroblastes semences sur le dessus du gel de fibrine à une concentration de 20 000 cellules par puits.
NOTES:
Habituellement, lorsque le gel de fibrine est formé, vous pourrez voir de minuscules bulles dans le gel. Ne vous inquiétez pas, ils vont disparaître en 3-4 jours.
Changer les médias tous les autres jours, c'est à dire, Jour 2, 4, 6, etc ..
En 3 ou 4 jours, vous devriez commencer à voir germer.
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Discussion
Il ya un consensus croissant selon lequel trois dimensions (3D) dans les essais angiogenèse in vitro offrent un modèle qui est beaucoup plus proche de l'environnement réel in vivo que peut être réalisé en utilisant des cultures 2D. Il est évident que la supériorité des systèmes 3D doit être reproductible et être capable d'imiter plusieurs des grandes étapes de l'angiogenèse. Bien que plusieurs dosages précédents 3D ont été développés, beaucoup de ces soit utiliser difficiles à obtenir des cellules microvasculaires, ou seulement ...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Billes Cytodex-3 | Réactif | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/flacon. Hydrater et gonfler 1,0 à 1,5 g de billes sèches dans 50 mL de PBS (pH = 7,4) pendant au moins 3 h à température ambiante. Utiliser un tube de 50 mL et le placer sur un agitateur rotatif. Laisser les billes se déposer (~ 15 min). Éliminer le surnageant et laver les billes quelques minutes dans du PBS frais (50 mL). Éliminer le PBS et remplacer par du PBS frais : 25 mL -> 20 mg/mL => 60 000 billes/mL ou 50 mL -> 10 mg/mL => 30 000 billes/mL. Placer la suspension de billes dans un flacon en verre silanisé (Windshield Wiper ou Sigmacote). Stériliser les billes par autoclavage pendant 15 min à 115°C. Conserver à 4°C. |
| Aprotinine | Réactif | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/flacon. Reconstituer l’aprotinine lyophilisée à 4 U/mL dans de l’eau DI. Filtrer stérilement. Préparer des aliquotes de 1 mL chacune. Conserver à -20 °C. |
| Fibrinogène de type I | Réactif | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissoudre le fibrinogène à 2 mg/mL dans du DPBS. Noter le pourcentage de protéine coagulable et ajuster en conséquence. Chauffer dans un bain-marie à 37 °C pour dissoudre le fibrinogène. Mélanger en retournant le tube. Ne pas vortexer. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 µm. |
| Thrombine | Réactif | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1 000 unités. Reconstituer dans de l’eau stérile à 50 U/mL. Préparer des aliquotes de 0,5 mL chacune. Conserver à -20 °C. |
Références
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
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