Method Article

Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

DOI:

10.3791/1863

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March 24th, 2010

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

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Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

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Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans

Protocol

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Culture cellulaire et d'induction des protéines A.

Cette section décrit les conditions de culture cellulaire, cycle cellulaire synchronisation avec Nocodazole, suivie par l'induction de l'expression de la protéine à partir d'un promoteur régulable dans des cellules de levure.

  1. La souche de type sauvage de levure W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) est transformé avec de copies (2μ) ADN plasmidique qui contient notre gène d'intérêt (ENTH2) sous le contrôle d'un promoteur répressible par la méthionine (MET25). 2 mM de méthionine est suffisante pour supprimer l'....

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Discussion

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Ce protocole décrit comment suivre le développement d'un phénotype morphologique (cellule de levure incapable de subir une division cellulaire proprement dite) sur surexpression de la protéine. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de récolter des cellules de levure par granulation à la vitesse de centrifugation recommandé que des vitesses plus rapides peuvent endommager les cellules et les résultats obscurs. Le bleu de méthylène et du blanc de calcofluor doit être ajoutée à des cel.......

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Acknowledgements

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Nous remercions Brian G. Coon et Claudia B. Hanna pour des discussions utiles et de soutien. Ce projet a été soutenu par fonds de démarrage du Dép. des sciences biologiques, Université de Purdue à R. Claudio Aguilar et une société américaine du cancer Subvention de recherche institutionnelle à R. Claudio Aguilar via le Centre de Purdue Cancer.

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Materials

Nom du produit Type Entreprise Numéro de catalogue Commenter
List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nocodazole Réactif Sigma (St. Louis, MO) M1404
Bleu de méthylène à 1% (p / v) Réactif VWR International VW6276-0
Calcofluor blanc Réactif Sigma (St. Louis, MO) F3543
Vaseline Réactif VWR International VW3339-2

References

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  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

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