La précision et la sensibilité du dosage des protéines par le test rapide et pratique Bradford est compromise par la non-linéarité intrinsèque. Nous montrons une procédure de linéarisation simple qui augmente considérablement la précision, améliore la sensibilité du dosage d'environ 10 fois, et réduit considérablement les interférences par les détergents.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Linéarisation du dosage des protéines Bradford
Dans cet article
Résumé
Résumé
Détermination des quantités de microgrammes de protéine de Bradford dans le bleu de Coomassie brillant essai est réalisé par la mesure de l'absorbance à 590 nm. Ce test permet de quantifier la plus courante de protéines rapides et simples dans les lysats cellulaires, les fractions cellulaires, ou des échantillons de protéines recombinantes, dans le but de la normalisation des mesures biochimiques. Toutefois, une non-linéarité intrinsèque compromis la sensibilité et la précision de cette méthode. Il est montré que dans des conditions test standard, le ratio des mesures d'absorbance à 590 nm et 450 nm est strictement linéaire avec la concentration de protéines. Cette procédure simple augmente la précision et améliore la sensibilité du dosage d'environ 10 fois, la quantification permettant à 50 ng d'albumine sérique bovine. Par ailleurs, le brouillage couramment introduites par les détergents qui sont utilisés pour créer les lysats cellulaires est fortement réduite par le nouveau protocole. Une équation linéaire développé sur la base d'une action de masse et la loi de Beer s'adapte parfaitement aux données expérimentales.
Protocole
Linéarisation du graphique d'étalonnage Bradford Protéines:
Le dosage de Coomassie brillant protéines bleu, communément connu comme le dosage de Bradford 1, est largement utilisé en raison de son protocole rapide et pratique ainsi que sa sensibilité relative. Malheureusement, il ya un grand degré de courbure sur une large gamme de concentrations de protéines (Fig. 1). Par conséquent, seule une gamme étroite de concentrations en protéines relativement élevée, 2-10 mg / ml de BSA, est utilisé pour la courbe d'étalonnage, ce qui correspond le mieux, puis de régression linéaire (Fig. 1, en vert). Cependant, la non-linéarité exige de ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Le dosage des protéines de Bradford est populaire en raison de sa facilité d'exécution et de la sensibilité relative. La linéarisation sur les concentrations de protéine ensemble de la gamme obtenue par le protocole présenté ici simplifie encore le dosage, comme des échantillons inconnus n'ont pas besoin de tomber dans la plage de la courbe d'étalonnage.
Fait important, le protocole prévoit en outre améliorée les avantages suivants sur l'original du protocole de Bradford:
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Remerciements
Cet article est dédié à la mémoire du regretté Dr Zvi Selinger, qui a accueilli la recherche originale décrite ici.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif de Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Albumine sérique bovine | Amersco | 0332 | |
| Lecteur d'absorbance Multiplate | BioTek | Synergy2 |
Références
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
