Assay Métastases expérimentales

Résumé

Cet article décrit les procédures d'un essai de métastases expérimentales qui est utilisé pour déterminer le potentiel métastatique de lignées cellulaires humaines de cancer.

Résumé

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Pour comprendre le mécanisme de métastases, un essai de métastases expérimentales a été établi en utilisant des souris immunodéficientes. Cet article définit les procédures impliquées dans cet essai, y compris la préparation des échantillons, l'injection intraveineuse, et la culture de cellules de métastases pulmonaires. Brièvement, un nombre prédéterminé de cellules cancéreuses humaines ont été préparés

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Cultiver des cellules confluentes à ~ 70% dans leurs médias spécifiques avec des facteurs de croissance ou de FBS (par exemple, DMEM avec du FBS à 10% pour le MC-1 cellules). Aspirer des médias de la plaque et laver délicatement à plusieurs reprises avec 1 x PBS (8 g / L de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na ₂ HPO ₄ .7 H ₂ O, 0,2 g / L de KH ₂ PO _4, pH 7,3).
2. Aspirer PBS et ajouter 2 mL de trypsine à 0,05% en versène (0,014 g / L de rouge de phénol et 0,2 g / L d'EDTA-Na dans 1 x PBS, pH 7,2). Secouez doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules de la plaque. Observez les cellules sous un microscope. Il prend généralement 2-5 minutes pour les cellules à se détacher.
3. Ajouter un volume suffisant de médias contenant FBS (ou inhibiteur de la trypsine de soja) pour étancher l'activité de la trypsine et de recueillir les cellules dans un tube de 50 ml faucon. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire sur un hématimètre propre. Le nombre de cellules par mL est égal à la moyenne # des cellules dans chacune des cinq carrés multipliée par 10 ^4.
4. Centrifuger les cellules à 1000 RPM (ou ~ 200 xg) dans une centrifugeuse de paillasse pendant 3 minutes.
5. Retirez délicatement les médias, sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans un volume approprié de solution tampon Hanks Balanced (HBSS) pour atteindre une concentration finale de ~ 5 x 10 ⁶ cellules / ml.
6. Filtrer à travers les cellules d'un Falcon 70 tamis cellulaire um d'exclure des agrégats à grandes cellules. Placez l'extrémité de la pipette directement sur le filtre sur un tube étiqueté culture 5mL Falcon. Vite éjecter la suspension à travers le filtre dans le tube de culture.
7. Compter les cellules de nouveau en utilisant un hématimètre et les diluer à une concentration finale de 2,5 x 10 ⁶ / mL. Gardez les cellules sur la glace.
8. Déterminer la viabilité des cellules. Mélanger quelques cellules au bleu trypan et de mesurer le pourcentage de morts (en bleu) des cellules sur les cellules total en utilisant un hématimètre. La viabilité des cellules doit être ≥ 90% avant l'injection.

2. Injection par voie intraveineuse

1. Changer de gants. Doucement attraper la queue d'une souris immunodéficientes (nude, NOD-SCID, ou GFN, Laboratoire Jackson) et tirez dans le dispositif de retenue de la souris, avec son dos contre la fente et sa queue qui sortait de la petite ouverture dans le dos de la de contention .
2. Faites glisser lentement vers l'intérieur de l'anneau le long de la fente et le verrouiller en place une fois l'anneau des prises de l'embouchure de la souris. La souris ne doit pas être en mesure de se déplacer librement, mais doivent avoir le taux normal de la respiration.
3. Trouvez les veines de la queue majeur. Quatre vaisseaux sanguins principaux sont présents dans une queue de souris. Les vaisseaux sanguins sur les côtés dorsale et ventrale de la queue sont les artères. Les veines sont sur les côtés latéraux de la queue.
4. Attirer plus de 200 ul de cellules préparées dans une seringue 1ml. Fixez l'aiguille 30 G 1 / 2 pouce et pousser les bulles d'air qui peuvent exister. Le volume final de cellules dans la seringue doit être 200 uL (soit 5 x 10 ⁵ cellules au total).
5. Injecter des cellules dans la veine de la queue.
   1. Démarrer à partir de l'extrémité distale de la queue, donc si le premier essai échoue, une région plus proximale de la queue pourrait être utilisé pour un deuxième essai.
   2. Essuyez la queue avec 70% d'éthanol. Tirez sur la queue droite. Maintenez la pointe de la queue avec le pouce et l'appui du point d'injection avec l'index.
   3. Insérez l'aiguille de la veine et injecter les cellules. Assurez-vous que l'aiguille et la seringue sont parallèles à la veine lors de l'injection, sinon l'aiguille se pointer à travers la paroi du vaisseau et d'injecter les cellules dans les tissus adjacents queue.
   4. Retirez l'aiguille après l'injection. Le sang doit abondante à partir du site d'injection si l'injection est allé avec succès. Appuyez sur un morceau propre de serviette en papier ou un coton tige sur le site d'injection pour faciliter la coagulation, et palper la queue vers le haut pour pousser tout échantillon résiduel dans la veine en circulation.
   5. Relâchez la souris à partir du dispositif de retenue et de le retourner à la cage. Enregistrez le processus d'injection (par exemple, combien d'essais il a fallu à injecter les cellules et combien cellules ont été injectées) dans un cahier de laboratoire.
   6. Déterminer la viabilité des cellules après l'injection, comme décrit dans la Section de préparation des échantillons, étape 9. Cette étape permet de rassurer que les cellules rester en vie tout au long du processus d'injection. A la fin d'une expérience d'injection, la viabilité des cellules vont diminuer, mais devrait être supérieure à 80%.
   7. (Optionnel) Isoler les cellules et rincer les restes les boulettes avec du PBS fois. Congelez les boulettes à -80 oC pour les analyses futures (par exemple, Western blot pour confirmer l'expression des gènes ou des passes rabattues).
6. Généralement, après un ou deux mois, les souris seront disséqués et les emplacements des métastases sont grossièrement déterminée. Du poumon est le site principal de métastases, car il contient le premier lit capillaire que les cellules après leur rencontrepénétrer dans la circulation.
7. Après rinçage avec du PBS, chaque lobe du poumon (ou d'autres tissus contenant des métastases) est observé sous un microscope à dissection (figure 1). Le nombre de métastases décelables sur les deux côtés du poumon est compté et le nombre de métastases pulmonaires sur l'ensemble des quatre lobes sont ajoutées comme le nombre total de métastases pulmonaires. ¹ métastases pulmonaires sont plus facilement détectées si les poumons sont fixés dans le formol durant la nuit , puisque les métastases se apppear que taches blanchâtres, contrairement à l'sombres adjacents tissus pulmonaires brun.

3. La culture de cellules de métastases pulmonaires

1. Métastases pulmonaires sont isolés de souris injectées. Chacun doit être cultivées séparément.
2. Chaque métastase est hachée par la fin d'un capuchon de l'aiguille (stérile) sur un tamis 70 pm cellule.
3. Rincer la crépine de cellule avec plusieurs mls de milieu et les cellules recueillies qui passent par le filtre dans une boîte de culture.
4. Incuber les cellules à 37 ° C pendant au moins quatre jours sans perturbation.
5. Laver le sang ou les débris de tissu sur le plat avec du PBS.
6. Ajouter un milieu frais. Au début, les cellules cancéreuses et les cellules fibroblastes se développent sur les plaques, mais progressivement, les cellules de fibroblastes va mourir et être remplacées par des cellules cancéreuses. Si les cellules cancéreuses portent pas de gènes résistant aux médicaments, sélectionnez les cellules avec des antibiotiques correspondants.
7. La pureté des cellules dérivées est évaluée par immunomarquage utilisant des anticorps contre des protéines spécifiques de l'homme. Nous utilisons un anticorps anti-vimentine humaine (NCL-VIM-V9, Novocastra). Les cellules nous avons dérivé contiennent typiquement plus de 99% de cellules humaines, même en l'absence de sélection des médicaments. Les cellules nouvellement obtenues pourraient être injectés dans des souris immunodéficientes nouveau de tester leurs capacités métastatiques, comme décrit ci-dessus.

4. Les résultats représentatifs

1. A la fin de cet essai, une ligne du cancer métastatique des cellules hautement donne habituellement lieu à de nombreuses métastases pulmonaires (figure 1), ¹ alors que les métastases pulmonaires très peu proviennent d'une lignée de cellules cancéreuses métastatiques mal.
2. Les cellules obtenues à l'aide de cette méthode donne généralement lieu à plus de métastases que la lignée parentale, quand ils sont testés à nouveau en utilisant ce dosage. ^1-3

Images représentant la figure 1. Des poumons de souris après des injections dans la veine caudale des cellules cancéreuses. 5 x 10 ⁵ de la ligne de mélanome métastatique de cellules humaines, cellules SM, ⁴ ont été injectés dans la veine de la queue des souris immunodéficientes. Deux mois plus tard, les poumons ont été isolées et les métastases ont été trouvés dispersés parmi le tissu pulmonaire normal.

Discussion

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Elle comporte quatre grandes étapes: le détachement des cellules cancéreuses de leurs loci primaire, leur mise en circulation (intravasation), leur sortie de la circulation (extravasation), et la survie et la croissance dans un organe à distance. Métastase dans l'homme est considéré comme un processus lent et qui se manifeste souvent après des années de latence. Pour étudier sa progression en temps opportun, le test ci-dessus rela...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
Rouge phénolique	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
Bleu trypan	Invitrogen	15250-061
Trypsine 2,5 %	Invitrogen	15090-046
Éthanol	Ultrapur	200-CSGP
50 ml Falcon Tube	VWR international	89039-656
Tubes de microcentrifugation	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70&mu ; m Filtre cellulaire	BD Biosciences	352350
5ml Falcon Culture Tube	VWR international	60818-576
Hémacytomètre	Hausser Scientific	15170-208
Seringue 1 ml	BD Biosciences	329650
30 ½ ; aiguille de jauge	BD Biosciences	305106
Souris restrainer	Plas Labs Inc.	551-BSRR
Ciseaux chirurgicaux	Fisher Scientific	08-940
Pince	Fisher Scientific	08-902
Microscope de dissection	Nikon Instruments	SMZ1500
centrifugeuse de paillasse	Thermo Fisher Scientific, Inc.