Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Résumé

Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l'utilisation d'un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d'observation et de quantification.

Résumé

Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui incluent des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et humains cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) sont des sources de cellules passionnante en raison de leur auto-renouvellement illimité des capacités et leur potentiel de se différencier en plusieurs types cellulaires. L'état pluripotent des hPSCs est généralement évaluée par des techniques telles que qPCR, immunocytochimie, et par d'autres

Protocole

Partie 1: Coloration Suspension immunocytochimique

1. Les cellules sont récoltées dans une suspension cellulaire unique.
2. Les cellules sont ensuite transférés dans des microtubes de 1,5 2mL et centrifugé à 200g pendant 4 minutes.
3. Les cellules sont lavées par l'aspiration à surnageant, remis en suspension dans 1ml de PBS - (sans Mg ^{2 +} et Ca ^{2 +)} et ensuite centrifugé à nouveau à 200g pendant 4 minutes. Cela devrait être fait deux fois.
4. Après lavage, les cellules sont alors fixées par remise en suspension eux dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) à température ambiante pendant 10 minutes.
5. Les cellules sont lavées à nouveau deux fois avec 1 mL de PBS -.
6. Après le lavage des cellules bloc, en re-suspension eux dans 1 ml de solution Block (6% serum/94% PBS -). Incuber ces à température ambiante pendant 45 minutes.
7. Après, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes et aspirer à la solution de bloc. Re-suspendre les cellules dans 1 ml de la solution d'anticorps primaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée). Les cellules peuvent être soit mis à incuber à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant une nuit avant de passer à l'étape suivante.
8. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec 1 ml de solution de bloc.
9. Après, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de solution d'anticorps secondaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée) et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
10. Après 1 heure, les cellules doivent ensuite être lavés à nouveau deux fois avec 1 ml de solution de bloc.
11. Après lavage avec une solution Block, laver les cellules à nouveau avec 1ml de PBS -.
12. Après les différents lavages, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de DAPI colorant nucléaire (1:10.000 dilution du DAPI dans PBS -) et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
13. Après 5 minutes, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes. Aspirer le DAPI solution de colorant nucléaire et de remettre en suspension les cellules dans 1ml de PBS -.

Incorporation de hPSCs dans les diapositives générées par un appareil cytospin: Partie 2

1. Diapositives en plastique sont préparés en faisant la quantité désirée de trous dedans avec une perceuse. Le diamètre doit être au plus 1 mm plus grand que le diamètre le plus large de la pointe micropipette (s) à être utilisé.
2. Le papier filtre est coupé à des paramètres de la glissière en plastique avec des ciseaux.
3. Les trous sont ensuite réalisés dans le papier filtre. La taille du trou (s) doit être assez grand pour que la pointe de micropipette (s) se range à travers elle.
4. Après, l'une des diapositives préparées en plastique est placé sur le dessus et une lame de verre dans placées au bas du papier filtre coupe (figure 1). Les couches sont sécurisés avec du ruban adhésif.
5. Un maximum de 100 ul (selon la densité désirée monocouche) de la suspension cellulaire teinté de la Partie 1 est ensuite placée dans le haut de la pointe micropipette (s).
6. Si nécessaire, l'appareil avec une solution de cellules peuvent être pesés et un contrepoids de poids similaire créé.
7. L'appareil cytospin et contrepoids peuvent sont ensuite placés dans une centrifugeuse de bureau et centrifugé à 200g pendant 4 minutes.
8. Après centrifugation, l'appareil est soigneusement démonté cytospin d'une manière qui ne marche pas déloger les cellules de la lame de verre.
9. Si nécessaire, l'excès entourant PBS - sur le côté verre dans aspirés hors.
10. Les cellules peuvent ensuite être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence pour vérifier si la monocouche cellulaire désiré a été atteint.

Partie 3: montage diapos

1. Une goutte de la presse de montage souhaité est placé directement dans le centre de chaque zone contenant des cellules.
2. Après, une lamelle est doucement descendu sur les diapositives en essayant d'éviter les bulles d'air, si possible.
3. L'excès des médias de montage est ensuite retiré de diapositives.
4. Après, les côtés de l'lamelles sont scellées avec du vernis à ongle.
5. Les diapositives peuvent être conservés dans une zone de stockage dans le noir avant que les résultats sont observés et documentés.

Discussion

Aux fins de notre laboratoire, un plat de 35mm de cultures de cellules souches cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est alloué pour la procédure de marquage immunocytochimique pour une utilisation avec l'appareil cytospin. Les cellules sont ensuite collectées par le biais du enzymatique repiquage, en supprimant autant de la couche MEF que possible, en une suspension à cellule unique. Si plus une isolation efficace de cellules souches à partir de la couche MEF est souhaitée, les colonies peuve...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame de chambre Lab Tek Permanox	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Matériau pour lames en plastique réutilisées
Lames de microscope Superfrost/Plus Prénettoyées	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10&mu ; L Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Couvercle de microscope en verre	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Support de montage
DPBS	GIBCO, par Life Technologies	14190
Sérum de chèvre normale	Invitrogen	10000C
Souris Anti-SSEA-4 Anticorps monoclonal	EMD Millipore	MAB4304	Anticorps primaire pour la coloration SSEA-4
Anticorps monoclonal anti-SSEA-3 Anticorps monoclonal	EMD Millipore	MAB4303	pour la coloration SSEA-3
Alexa Fluor 488 Anticorps anti-souris de chèvre	Invitrogen	A11029	Anticorps secondaire pour la coloration SSEA-4
Alexa Fluor 488 Anticorps secondaire anti-rat marqué	Invitrogen	A11006	la
coloration SSEA-3DAPI, dichlorhydrate	calbiochimique	268298