Les aptamères sont sélectionnés par ribo-/deoxyribo-oligonucleotides courte In-vitro Les méthodes basées sur l'évolution affinité pour une cible spécifique. Les aptamères sont des outils de reconnaissance moléculaire avec polyvalente applications thérapeutiques, diagnostiques et de recherche. Nous démontrons méthodes de sélection des aptamères pour amyloïde β-protéine, l'agent causal de la maladie d'Alzheimer.
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Article de méthode
Sélection d'aptamères pour amyloïde β-protéine, l'agent causal de la maladie d'Alzheimer
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie d'Alzheimer (MA) est une progressive, dépendant de l'âge, maladie neurodégénérative avec une évolution insidieuse qui rend son diagnostic présymptomatique difficiles 1. AD diagnostic définitif est réalisé l'autopsie seulement, établissant ainsi présymptomatique, le diagnostic précoce de la MA est crucial pour développer et administrer des traitements efficaces 2,3.
Amyloïde β-protéine (Aß) est au centre de la pathogenèse AD. Soluble, oligomérique assemblées Aßi auraient des effets sur la neurotoxicité dysfonction sous-jacente synaptique et la perte de neurones dans l'AD 4,5. Diverses formes de Aß solubles assemblées ont été décrits, cependant, leurs interrelations et de la pertinence de l'étiologie et la pathogenèse AD sont complexes et mal comprises 6. Des outils spécifiques de reconnaissance moléculaire peut démêler les relations entre les assemblées Aßi et de faciliter la détection et la caractérisation de ces assemblées au début de l'évolution de la maladie avant que les symptômes apparaissent. La reconnaissance moléculaire s'appuie souvent sur des anticorps. Cependant, une autre classe d'outils de reconnaissance moléculaire, des aptamères, offre des avantages importants par rapport aux anticorps 7,8. Les aptamères sont des oligonucléotides générés par la sélection in vitro: l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) 9,10. SELEX est un processus itératif qui, semblable à l'évolution darwinienne, permet la sélection, d'amplification, d'enrichissement, et la perpétuation d'une propriété, par exemple, avide, ligand spécifique, contraignant (aptamères) ou de l'activité catalytique (ribozymes et ADNzymes).
Malgré l'émergence d'aptamères comme outils de la biotechnologie moderne et la médecine 11, ils ont été sous-utilisés dans le domaine de l'amyloïde. Peu ou ARN aptamères ADNss ont été sélectionnés contre les différentes formes de protéines du prion (PrP) 12-16. Un aptamère ARN générés contre la PrP recombinante bovine a été montré à reconnaître la PrP bovine β-17, une forme soluble, oligomérique, β-feuille riche en variantes de conformation de la PrP pleine longueur qui forme des fibrilles amyloïdes 18. Les aptamères générés en utilisant les formes monomériques et plusieurs de β 2-microglobuline fibrillaire (β 2 m) ont été trouvés pour lier les fibrilles de certaines autres protéines amyloïdogéniques dehors β 2 m 19 fibrilles. Ylera et al. décrit aptamères d'ARN sélectionnés contre immobilisé monomère Aß40 20. De façon inattendue, ces aptamères liés fibrillaire Aß40. Au total, ces données soulèvent plusieurs questions importantes. Pourquoi aptamères sélectionnés contre des protéines monomériques reconnaître leurs formes polymères? Pourriez aptamères contre les formes monomères et / ou oligomères de protéines amyloïdogéniques être obtenus? Pour répondre à ces questions, nous avons tenté de sélectionner des aptamères pour covalente stabilisée oligomères Aß40 21 généré en utilisant la photo-induite de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) 22,23. Similaires aux constatations antérieures 17,19,20, ces aptamères ont réagi avec des fibrilles de Aß et de plusieurs autres protéines amyloïdogéniques susceptible de reconnaître une substance amyloïde potentiellement communes structurelles aptatope 21. Ici, nous présentons la méthodologie utilisée dans la production SELEX de ces aptamères 21.
Protocole
Partie 1: préparation de protéines et de réticulation
Initialement, la protéine utilisée pour SELEX est prétraitée avec 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour obtenir homogène, sans agrégat préparations, comme décrit précédemment 23. Cette étape est nécessaire car pré-formé des agrégats induire l'agrégation rapide des protéines amyloïdogénique, résultant en mauvaise reproductibilité expérimentale 24 ans, et sont indésirables pour la sélection d'aptamères pour le non agrégés, non fibrillaires formes de la protéine.
- Peser ~ 800 pg (~ 180 nmol) pur Aß40 utilisant une microbalance. Transfert du peptide ....
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Discussion
Le point de départ du processus SELEX est la synthèse d'une bibliothèque d'oligonucléotides aléatoires contenant typiquement 10 12 -10 15 séquences. Dans l'ADN SELEX, cette bibliothèque est utilisée directement après une piscine ADNss est généré, alors que dans l'ARN SELEX, démontré ici, la bibliothèque ADNss est convertie d'abord à un pool d'ARN enzymatiquement par transcription in vitro. Puis, SELEX est réalisé itérativement lequel chaque cycle comprend l.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH AG030709 / NIA et 07-65798 du California Department of Public Health. Nous reconnaissons Margaret M. Condron pour la synthèse peptidique et de l'analyse des acides aminés, le Dr Elizabeth F. Neufeld pour les aider et de soutenir les premières étapes du projet, le Dr Chi-Hong Chen B. de fournir un soutien et des réactifs, et le Dr Andrew D . Ellington pour les discussions utiles.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aβ40 | Laboratoire des biopolymères de l'UCLA | Poudre lyophilisée | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Tubes de 1,6 ml revêtus de silicium | Denville Scientific | C19033 ou C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Utiliser sous une hotte chimique. |
| Persulfate d'ammonium | Sigma-Aldrich | A-7460 | Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Le APS est préparé frais à chaque utilisation et doit être utilisé dans les 48 heures. |
| Tris(2,2-bipyridyl)dichlororuthénium(II) hexahydraté | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Recouvrir le tube de RuBpy d'une feuille d'aluminium pour protéger le réactif de la lumière ambiante. Le RuBpy est préparé frais à chaque utilisation et doit être employé dans les 48 heures. |
| Dithiothréitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ colonnes de désalinisation | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| acétate d'ammonium | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Tubes de 0,6 ml revêtus de silicium | Denville Scientific | C19063 | |
| Gels Novex Tricine (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10 puits ; format mini (8 cm x 8 cm) ; 25 μl volume de chargement par puits ; plage de séparation de 5 kDa à 40 kDa |
| Cuvette en quartz | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotomètre | Beckman Coulter Inc. | ||
| bibliothèque d'ADN simple brin | Integrated DNA Technologies | Sur commande personnalisée | La bibliothèque a été conçue pour contenir 49 nucléotides aléatoires encadrés par deux régions constantes comprenant des sites de liaison des amorces et de clonage : 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N : 25 : 25 : 25 : 25 %) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq polymérase ADN | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus ADN polymérase fournie avec 10× Tampon PCR et un tube séparé de MgCl₂ 25 mM2 pour la PCR courante. |
| PCR Nucleotide Mix, solution 10 mM | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM chacun de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Amorce avant | Integrated DNA Technologies | Sur commande personnalisée | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Amorce reverse | Integrated DNA Technologies | Sur commande | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermostat de PCR | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| Kit de purification QIAquick PCR (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Tubes coniques stériles de 1,6 ml avec bouchons munis de joints toriques | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Système de production d'ARN à grande échelle–T7 | Promega Corp. | P1300 | Le kit contient : 120 μl'enzyme mix (ARN polymérase, RNasin recombinante)® inhibiteur de ribonucléase et pyrophosphatase inorganique recombinante) ; 240 μtampon de transcription 5 ; 100 μl chacun des 4 rNTPs, 100 mM ; 110 U de DNase RQ1 sans RNase, 1 U/μl; 10 μADN témoin linéaire, 1 mg/ml ; 1 ml d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) ; 1,25 ml d'eau sans nucléase |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9,25 MBq) | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Activité spécifique : 3000 Ci (111 TBq)/mmol, Tricine 50 mM (pH 7,6) |
| Phénol saturé au citrate : chloroforme : alcool isoamylique (125:24:1, pH 4,7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroforme : alcool isoamylique (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Éthanol absolu pour biologie moléculaire | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| centrifugeuse microcentrifuge réfrigérée Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ Colonnes micro G-50 | GE Healthcare | Obtenu auprès de Fisher Scientific (45-001-487) | Préemballé avec du Sephadex™ G-50 de qualité ADN, pré-équilibré dans un tampon STE contenant 0,15 % de Kathon comme biocide |
| Compteur de scintillation de table Triathler | Hidex Oy, Turku, Finlande | Modèle Triathler LSC : 425-034 | |
| Novex® Tampon d'échantillonnage TBE-Uréa (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| Gels TBE-Uréa 6 %, 1,0 mm, 10 puits | Invitrogen | EC6865BOÎTE | |
| Novex® Tampon de migration TBE (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Désinfectant contre la radioactivité | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Embouts de chargement pour gel | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-cellule | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-cellule |
| Film d'autoradiographie | Denville Scientific | E3018 | Utilisation en totale obscurité |
| film d'autoradiographie, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Peut être utilisé sous lumière rouge de sécurité. |
| Disques membranaires | EMD Millipore | GSWP02500 | Ester mixte de cellulose, hydrophile, 0,22-μmembranes de disque m |
| Base de support en verre fritté pour flacon de 125 ml | VWR international | 26316-696 | |
| Plaques de Pétri | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urée | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogène | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-propanol pour biologie moléculaire | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Inhibiteur recombinant de la RNase | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Système de transcription inverse | Promega Corp. | A3802 | |
| Inhibiteur recombinant de RNase | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Colorant de charge | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
Références
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
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Réimpressions et autorisations
