Method Article

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

DOI:

10.3791/1963

⸱

June 12th, 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

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Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Abstract

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Enquête sur la fonction des gènes dans des organismes variés s'appuie sur la connaissance de la façon dont les produits des gènes interagissent les uns avec les autres dans leur environnement cellulaire normal. La complémentation bimoléculaire fluorescence (BiFC) Assay

Protocol

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I. préparation de plasmide

L'ADN plasmidique utilisé pour le bombardement doit être de haute pureté et à une concentration de 500ng/μl ou supérieure. Pour BiFC impliquant deux constructions plasmidiques, 25 pg de chaque plasmide est nécessaire. En d'autres termes, rapport molaire 1:1 des deux plasmides doivent être mélangés pour donner naissance à 50 pg d'ADN plasmidique total pour la préparation des cartouches. Soyez conscient que l'ajout de plus d'ADN de 50 mg peut provoquer une agglomération des particules d'or et devrait être évitée. Disponibles dans le commerce des kits d'extraction d'ADN plasmidique sont recommandés pour les isoler de....

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Discussion

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  1. Pour les utilisateurs de première fois, nous vous recommandons de pratiquer toute la procédure, de la préparation Cartouche d'observation, avec un seul reporter constitutive plasmide tel que 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Nous avons utilisé un 35S:: plasmide GFP obtenu de MM. Steve Mount et Zhang Xiaoning 6 (figure 1A, D). Les cartouches gène tiré de contrôle vendus à RioRad (Cat 165-2244) ne sont pas appropriées pour les plantes.
  2. Pour BiFC, un deuxième contrôle positif est nécessaire, ce qui devrait se composent de d.......

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Disclosures

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

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Nous remercions les Drs. Steve Mount et Zhang Xiaoning pour le 35S:: GFP pGlowbug construire et l'Hokensen Bourse de doctorat au CH de recherche dans le laboratoire de Z. L's est soutenue par le US National Science Foundation (IOB0616096 et MCB0744752). ZL est partiellement pris en charge par l'Université du Maryland de la station expérimentale agricole.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oignon jauneTout fournisseur Helios
Gene GunBio-Rad
Microscope fluorescent avec filtres appropriés pour GFP ou YFPZeiss, Nikon, Olympus

References

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  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.

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Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

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