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Summary

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

Abstract

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon vertébré précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Dans les embryons de poisson zèbre, l'injection des résultats d'ADN plasmidique dans l'expression de la mosaïque, permettant la visualisation de cellules individuelles ou de petits amas de cellules¹. Nous décrivons comment l'injection de l'encodage d'ADN plasmidique membrane cible Green Fluorescent Protein (mGFP) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire peut être utilisé pour les cellules de l'imagerie subissant la neurulation. Au centre de ce protocole est la méthodologie utilisée pour l'imagerie des cellules marquées à haute résolution dans les sections et aussi en temps réel. Ce protocole implique l'injection d'ADN dans des embryons de poisson zèbre mGFP jeunes. Les embryons sont ensuite traitées pour sectionner vibratome, l'étiquetage d'anticorps et d'imagerie avec un microscope confocal. Alternativement, les embryons vivants exprimer mGFP peuvent être imagées par time-lapse microscopie confocale. Nous avons déjà utilisé cette approche simple pour analyser les comportements cellulaires qui déterminent la formation du tube neural dans la région du cerveau postérieur de l'embryon de poisson zèbre². Les préparatifs fixes a permis pour la visualisation sans précédent des formes de cellules et de l'organisation dans le tube neural, tandis que l'imagerie vivre complété cette approche permettant une meilleure compréhension de la dynamique cellulaire qui se déroulent pendant la neurulation.

Protocol

1.Microinjection

1. Diluer plasmide codant pour la membrane-cible Green Fluorescent Protein (mGFP, gracieuseté de Richard Harland) à une concentration de 40 ng / ml. L'ADN est préparé par linéarisation plasmide (mGFP/PCS2 +, gracieuseté de Richard Harland) purifiés en utilisant le kit Qiagen Maxi Prep. Ajout de rouge de phénol (dilué 1 / 10 volume total) à la solution est préférable de visualiser la solution. Conserver la solution d'ADN sur la glace.
2. En vertu d'un stéréomicroscope, calibrer l'aiguille d'injection (90mm capillaires en verre à partir Narishinge scientifique; Cat n ​​° AN-GD-1) en alignant l'aiguille sur une lame de diplôme et tapotant doucement la partie de l'aiguille dont le diamètre est 1 um en utilisant un rasoir propre lame (pour obtenir un bout de la taille appropriée).
3. Pour calibrer l'aiguille pour injecter un volume connu (2NL), connectez l'aiguille de l'appareil micro-injection (PCI 100 microinjecteur; Harvard Apparatus) et avant de remplir l'aiguille avec 0.5μl d'une solution contenant du rouge de phénol et d'eau placé sur un morceau de la paraffine. La solution peut être distribuée en utilisant une pédale. Régler la pression à 7 kPa et de varier le temps (10msec 30msec) pour qu'il prenne 250 pédales à dispenser 0.5μl de la solution.
4. Placez délicatement l'aiguille calibrée sur une bande de cire dans un plat humidifié à 100 mm de Pétri. Pour humidifier le plat, placer Kimwipes humides sur les bords (ce qui empêche l'évaporation de la solution dans l'aiguille).
5. Utiliser une micropipette pour charger 0,5 1 microlitre d'ADN dans la fin d'aiguille (l'extrémité qui n'était pas étalonnée).
6. Une fois la solution a atteint la pointe de l'aiguille, connectez l'extrémité de l'aiguille qui a été utilisé pour le chargement d'un appareil de micro-injection. Réglez les paramètres sur la microinjecteur livrer environ 2 nl / injection à l'aide d'une pédale.
7. Ensuite, les embryons de poisson zèbre position au milieu d'une boîte de Pétri remplie de milieu d'embryon (Stock 1,0 ml de Hank # 1, 0,1 ml de bouillon de Hank # 2, Stock 1,0 ml de Hank # 4, 95,9 ml ddH ₂ O, Stock 1,0 ml de Hank # 5 , Stock 1,0 ml frais de Hank # 6, Utiliser environ 10 gouttes de NaOH 1 M à pH 7,2).
8. Une fois que les embryons se sont développés à l'étape désirée, doucement l'emprise du chorion avec des pinces fines et de situer l'aiguille dans la zone ciblée pour l'injection. Pour une expression large éventail mGFP, injecter de l'ADN dans le jaune ou le cytoplasme au stade 1CELL. Pour restreindre l'expression de mGFP à une plus petite région, injecter de l'ADN à la 4 (ou plus) stade de cellules dans le cytoplasme d'une cellule unique.
9. Appuyez sur la pédale de l'appareil de micro-injection et de livrer environ 2 nl, en s'assurant que la solution (visible en raison de l'ajout de rouge de phénol) est correctement injecté.
10. Retirer délicatement l'aiguille de l'embryon.
11. Répétez l'opération pour tous les embryons dans la boîte de Pétri.
12. Autoriser les embryons se développer à 28,5 ° C à l'étape désirée.
13. Embryons Dechorionate par un léger décollement du chorion en utilisant une pince fine (si les embryons sont plus jeunes que 24hpf, dechorionating dans un plat en verre de Petri augmente le taux de survie des embryons).
14. Retirer chorion vide de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette en verre.

2. Imagerie mGFP marqué sections vibratome

1. Utiliser une pipette en verre pour le transport d'embryons dans fixateur (paraformaldéhyde 4% dans une solution tampon phosphate 1X (PBS). Fix embryons à 4 ° C pendant la nuit.
2. Lavez embryons dans du PBS 1X 3 fois pendant 5 minutes chacune.
3. Placer les embryons dans une boîte de Pétri et, à l'aide de pinces fines, retirez les jaunes sans abîmer l'embryon. Enlever le jaune autant que possible.
4. Préparer 4% d'agarose faible point de fusion de H ₂ O.
5. Placez agarose fondu dans le moule en plastique de sectionnement.
6. Utilisez une pince fine pour soulever un embryon injecté à partir de la boîte de Pétri et de placer et d'orienter dans l'agarose. L'embryon doit être positionné vers une extrémité du moule.
7. Une fois que l'agarose est durcie, utilisez un outil de surface plane, comme une spatule, d'enlever le bloc d'agarose du moule.
8. Coupez l'extrémité inférieure du bloc d'agarose avec une lame de rasoir afin qu'elle est encore.
9. Ajouter une goutte de super glue sur la scène vibratome et placer le bloc d'agarose sur elle (le côté du bloc qui a été stabilisée avec le rasoir doit faire face à la colle). Pour sectionner plusieurs embryons, monter plusieurs agarose-embedded spécimens sur la scène.
10. Fixez le stade de la vibratome vibratome (Vibratome, Inc.)
11. Définissez les paramètres de l'vibratome (paramètres communs: vitesse-3, épaisseur 50 microns-). Si sectionner plusieurs embryons, aligner des blocs d'agarose sur la scène et de s'assurer que la lame passe à travers l'embryon entier, mais pas toute la largeur des blocs d'agarose (tels que les articles correspondant à l'embryon sera de même rester ensemble).
12. Verser du PBS 1X à l'étape de vibratome.
13. Section.
14. Une fois que les embryons sont sectioNed, retirez le bloc d'agarose (s) de la scène vibratome.
15. Soigneusement séparer chaque section par la coupe à l'arrière du bloc d'agarose (s).
16. Utilisez une pince fine de sélectionner les sections désiré et le placer dans un PBS 1X rempli multi-même plat (utiliser différents puits pour les sections correspondant aux différents embryons).
17. Répétez l'opération pour chaque embryon.
18. Procéder à l'étiquetage des anticorps, les étapes 19 mais 23, pour améliorer l'imagerie mGFP (cette étape peut-être pas nécessaire si les articles sont imagés dans un ou deux jours de préparation).
19. Traiter sections pendant 30 minutes à température ambiante avec une solution de blocage dans du PBS 1X à bloquer la liaison non spécifique.
20. Sections Incuber avec l'anticorps primaire (lapin une-GFP, Invitrogen Cat n ​​° A11122) dilué @ 1:200 dans la solution de blocage sur un agitateur pendant 5 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
21. Laver quatre fois (10 min, 15 min, 30 min et 60 min, chaque) dans 1% BSA/1X PBS / 1% solution de DMSO.
22. Traiter avec un anticorps secondaire sections appropriées dans une solution de blocage pendant 5 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
23. Laver quatre fois (10 min, 15 min, 30 min et 60 min, chaque) dans 1% BSA/1X PBS / 1% solution de DMSO.
24. Traiter les sections au DAPI (0,1% en DAPI 50ml PBS 1X; Invitrogen Cat n ​​° D1306) pendant 30 minutes pour colorer les noyaux.
25. Laver trois fois dans du PBS 1X pendant 5 minutes chacune.
26. Mont sur la diapositive.
27. Image en utilisant la microscopie confocale.

3. En direct d'imagerie

1. Dechorionate vivants, d'embryons injectés 30 minutes avant qu'elles n'atteignent le stade désiré de développement. Placer les embryons dans une solution de sédatif (0,01% en moyenne tricaïne embryon) pendant 15 min.
2. Déposer une goutte de 1% d'agarose sur une boîte de culture à fond de verre 35mm (MatTek; Partie n ° P35G-o-20-C).
3. Autoriser agarose à se solidifier.
4. Le tube capillaire sur la flamme de chaleur pour faire trois trous dans agarose (d'autres objets tels que des conseils micropipette peut être utilisé pour faire les trous). Assurez-vous qu'il n'y a aucune résiduelle agarose dans le fond du trou.
5. Remplissez la boîte de Pétri avec des moyennes d'embryon.
6. Utiliser une pipette en verre pour placer l'embryon dans le trou.
7. Ensuite, d'orienter l'embryon à l'aide de pinces fines pour que la zone à imager (tête dorsale) est en contact avec le verre.
8. Soigneusement le transport des boîtes de Pétri à la platine du microscope (placer le couvercle sur la boîte de Pétri pour empêcher l'évaporation).
9. Alors que l'imagerie, s'assurer que les embryons sont à 28,5 ° C.

4. Résultats

Nous décrivons ici une approche simple pour les cellules seule image dans le tube neural de poisson zèbre en utilisant l'expression de la mosaïque. En dépit de la transparence optique de l'embryon de poisson zèbre, nous avons constaté que la visualisation des cellules neurales est grandement améliorée dans les sections obtenues en utilisant un vibratome. Ces sections sont épais (50 mm) permettant à l'imagerie d'extension cellulaire d'une cellule donnée dans les différents plans focaux à l'aide d'un microscope confocal. Résultats utilisant cette méthodologie ont été publiés ailleurs ^2, mais des images représentatives de cellules dans le tube neural d'un embryon WT (figure 1) et une N-cadhérine (N-CAD) mutant (figure 2) sont fournis. Ce dernier révèle que les cellules dans les régions latérales de la plaque neurale en N-cad mutants ne parviennent pas à s'orienter correctement vers la ligne médiane (figure 2). Contrairement à cet étiquetage mosaïque, immunomarquage neuroépithélium avec un marqueur de surface cellulaire générales telles que la bêta-caténine ne permet pas la morphologie des cellules individuelles pour être visualisées (figure 3).

Imagerie time-lapse d'embryons vivants complété l'étiquetage des échantillons fixés mosaïque, permettant une meilleure compréhension de la dynamique cellulaire qui se déroulent pendant la neurulation. Film 1 a révélé que les cellules WT migrent activement vers la ligne médiane par l'extension des protubérances membranaires médiane orientée.

Figure 1. MGFP d'expression dans le tube neural d'un embryon de poisson zèbre WT.

Figure 2. MGFP d'expression dans le tube neural d'un embryon de poisson zèbre N-cadhérine.

Figure 3. B-caténine coloration immuno du neuroépithélium.

Discussion

En conclusion, les techniques de marquage décrites ici permettent une analyse simple cellule de processus morphogénétiques dans l'embryon de poisson zèbre. L'accent principal de ce protocole est sur les méthodes d'imagerie des cellules étiquetées dans le tube neural en utilisant mGFP sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire. Pour des applications supplémentaires de ce test d'expression transitoire de lecteurs devraient se référer à un document récent de Andersen et al. ^3.

Materials

<p class="jove_title">Solutions</p>

<ul> <li>Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #2: 0.358 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> Anhydrous, 0.60 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> in 100 ml ddH<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl<sub>2</sub> in 50 ml ddH<sub>2</sub>O</li> <li>Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O in 50 ml dd H<sub>2</sub>O</li> <li>1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3</li> <li>Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)</li> </ul>