Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

Résumé

Drosophila Schneider (S2), les cellules sont un système de plus en plus populaire pour la découverte et l'analyse fonctionnelle des gènes. Notre objectif est de décrire quelques-unes des techniques microscopiques qui rendent les cellules S2 un tel système en plus important d'expérimentation.

Résumé

Le système idéal d'expérimentation serait bon marché et facile à entretenir, se prêtant à une variété de techniques, et serait soutenu par une abondante littérature et de base de données la séquence du génome. Des cultures de cellules S2 de drosophile, le produit des embryons de 20 à 24 heures dissocié ancienne ^1, possèdent toutes ces propriétés. Par conséquent, les cellules S2 sont extrêmement bien adapté pour l'analyse des processus cellulaires, y compris la découverte des gènes codant pour les composants moléculaires du processus ou mécanisme d'intérêts. Les caractéristiques des cellules S2 qui sont les plus responsables de leur utilité sont la facilité avec laquelle ils sont maintenus, leur sensibilité exquise à double brin (ds) ARN médiée par l'interférence ARN (ARNi), et leur traçabilité à la microscopie par fluorescence que ce soit en direct ou fixes cellules.

Les cellules S2 peuvent être cultivés dans une variété de médias, y compris un certain nombre de bon marché, disponibles dans le commerce, entièrement défini, un milieu sans sérum ^2. De plus, ils poussent de façon optimale et rapide à 21-24 ° C et peuvent être cultivées dans une variété de conteneurs. Contrairement aux cellules de mammifères, les cellules S2 ne nécessitent pas une atmosphère régulée, mais plutôt bien faire avec l'air normal et peut même être maintenu dans des flacons étanches.

Complétant la facilité de l'ARNi dans les cellules S2 est la capacité à analyser les phénotypes facilement induite expérimentalement par phase ou la microscopie à fluorescence de cellules fixées ou vivantes. Les cellules S2 grandir dans la culture comme une seule monocouche, mais ne pas afficher l'inhibition de contact. Au lieu de cela, les cellules ont tendance à croître en colonies dans les cultures denses. A faible densité, les cultures cultivées sur S2 en verre ou en culture de tissus traités en plastique sont ronds et peu-joint. Toutefois, l'examen cytologique des cellules S2 peut être grandement améliorée en les incitant à aplatir en cultivant intensivement brièvement eux sur une surface revêtue de la lectine, la concanavaline A (ConA) ^3. Les cellules S2 peut aussi être transfectées de façon stable avec des marqueurs marqués par fluorescence à des structures étiquette ou organites d'intérêt dans les cellules vivantes ou fixées. Par conséquent, le scénario habituel pour l'analyse microscopique des cellules est la suivante: d'abord, les cellules S2 (qui peuvent posséder des transgènes à exprimer des marqueurs marqués) sont traitées par RNAi pour éliminer une protéine cible (s). Temps de traitement ARNi peut être ajusté pour tenir compte des différences dans les protéines turn-over cinétique et pour minimiser les traumatismes de cellules / décès si la protéine cible est importante pour la viabilité. Ensuite, les cellules traitées sont transférés dans une boîte contenant une lamelle pré-enduites de conA d'induire les cellules à se répandre et bien adhérer au verre. Enfin, les cellules sont imagés avec le choix du chercheur de modes de microscopie. Les cellules S2 sont particulièrement bonnes pour les études nécessitant la visualisation prolongée des cellules vivantes, puisque ces cellules rester en bonne santé à la température ambiante et une atmosphère normale.

Protocole

1. Préparation des cellules S2 pour la microscopie

Cellules Schneider S2 ont été tirées de la trypsine embryons fin de l'Oregon R drosophile. Culture d'origine de Schneider se composait d'un mélange de types de cellules, mais sont devenus plus homogènes avec passage continu ^1. Ils ont été décrits comme étant de type macrophage (ils sont phagocytaire) avec l'expression du gène hémocytes-like. Les cellules S2 peuvent être obtenus auprès de l'ATCC, DGRC, ou Invitrogen.

A. Sélection de milieu de croissance

Un certain nombre de médias ont été utilisées pour cultiver des c....

Discussion

Pour le domaine de la biologie cellulaire, un système idéal serait peu coûteux à entretenir, facile à manipuler, et se prêtent à une variété de techniques. Cellules S2 de drosophile satisfaire à ces exigences, et donc ils sont rapidement devenus le système de choix pour un nombre croissant de cellules les laboratoires de biologie.

Nous avons présenté un bref aperçu des méthodes pour préparer les cellules S2 pour la microscopie. Une vertu notable de cellules S2 est le fait qu'ils.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules S2	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
Cellules S2	DGRC	numéro de stock 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
Cellules S2	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	milieu sans sérum
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	milieu sans sérum
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	milieu sans sérum
Milieu Schneider’s S2	Invitrogen	11720-034	Ajouter 10 % (concentration finale) de FBS inactivé par la chaleur pour obtenir un milieu complet.
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10438026	inactivé par la chaleur
Solution antibiotique 100x	MP Biomedicals	91674049	contient de la pénicilline (10000 U/mL), de la streptomycine (10000 μg/mL) et de l'amphotéricine B (25 μg/mL)
Concanavaline A	MP Biomedicals	195283
Formaldéhyde	Electron Microscopy Sciences	15714	solution à 32 %
Méthanol	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	anhydre, qualité ACS
Cribles moléculaires	Acros Organics	19724	type 3A