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Ce protocole est un extrait de Sarasija et Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Croissance et synchronisation de la population de nématodes
Ces animaux atteindront le stade larvaire L4 après ~42 h. À ce moment, déplacer les larves L4 à l’aide d’un pic de platine dans des plaques NGM ensemencées OP50 contenant 0,5 mg/mL de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR) pour les empêcher de produire une descendance.
NOTE Assurez-vous qu’au sein d’une expérience, toutes les souches sont synchronisées pendant une durée similaire. Le traitement FUdR stérilise les animaux et empêche la ponte et la production de descendance, ce qui pourrait influencer l’OCR. Ces animaux stérilisés seront analysés le lendemain (jour 1 animaux adultes à ~66 h) pour le dosage. Il a été rapporté que FUdR a un impact sur la physiologie et la durée de vie de certains vers mutants. Par conséquent, cela doit être pris en considération lorsque le médicament est utilisé pour la stérilisation. Les vers peuvent également être stérilisés au moyen de mutations féminisantes telles que fem-1(hc17) ou fem-3(e2006). Cependant, ces mutations pourraient avoir un impact sur la fonction mitochondriale.
- Transférez les larves L4 du patrimoine génétique souhaité (p. ex., animaux N2 [type sauvage] et sel-12) sur des plaques de milieux de croissance de nématodes (voir le tableau 1 pour la recette) fraîchement ensemencées avec une pelouse d’Escherichia coli (OP50). Utilisez au moins deux plaques de 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche. Incuber les vers à la température de croissance appropriée (entre 15 et 25 °C) pendant 3 à 4 jours ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravides.
- Lavez les œufs et les vers des plaques à l’aide d’environ 6 ml de tampon M9 (voir le tableau 1 pour la recette) par plaque de 100 mm de nématodes et transférez-les avec des pipettes Pasteur en verre dans des tubes à centrifuger individuels de 15 ml pour chaque souche. Faites tourner ces tubes pendant 3 minutes à 6 180 x g et aspirez le tampon M9, en ne conservant que les animaux et les œufs granulés.
- Ajouter 3 à 4 ml de solution d’eau de Javel (voir le tableau 1 pour la recette) dans chaque tube et agiter par intermittence pendant 6 min. Ajouter un tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 x g pendant 1 min et aspirer le surnageant. Répétez ce lavage avec M9 trois fois et placez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 ml contenant environ 9 ml de tampon M9.
- Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 °C pendant 16 à 48 h. Faites tourner ces tubes à 6 180 x g pendant 1,5 min et déposez les animaux L1 synchronisés sur des plaques NGM individuelles fraîchement ensemencées avec une pelouse d’OP50 (environ 6 000 à 10 000 animaux par plaque de 100 mm) et maintenez à 20 °C.