Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires : une méthode de culture cellulaire tridimensionnelle (3D)

Résumé

Source : Dillard, P., et al. A Essai de destruction de sphéroïdes par cellules CAR-T. J. Vis. Exp. (2018).

Les sphéroïdes sont un type de modèle de culture cellulaire 3D utilisé pour représenter plus précisément l’environnement d’une cellule par rapport aux modèles monocouches de culture cellulaire 2D. Dans l’exemple de protocole, nous verrons les scientifiques générer des sphéroïdes à partir d’une lignée cellulaire de cancer colorectal et appliquer l’imagerie de cellules vivantes pour suivre la croissance des sphéroïdes.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires de cancer colorectal

1. Laver HCT 116 (transduit de manière stable pour exprimer les monocouches cellulaires du groupe de différenciation 19 (CD19) et de la protéine de fluorescence verte (GFP)) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 5 mL pour un flacon de 25 cm² ou 10 mL pour un ballon de^{75 cm 2}). Ajouter la trypsine (0,5 mL pour une fiole de 25 cm² ou 1 mL pour une fiole de 75 cm²) et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
2. Vérifier le décollement cellulaire au microscope et neutraliser l’enzyme de dissociation cellulaire à l’aide d’un milieu complet du Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10 % de FCS + gentamycine ; 10 mL pour une fiole de 25 cm² ou 20 mL pour une fiole de 75 cm²).
3. Suspension de la cellule de centrifugation à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipetant de haut en bas plusieurs fois avec 5 mL de milieu RPM1 1640 complet.
4. Comptez les cellules à l’aide de l’exclusion du bleu Trypan sur un compteur de cellules compatible.
5. Suspension cellulaire de centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 5 x 10³cellules/mL.
6. Enduire une plaque à fond rond de 96 puits avec 100 μL/puits de 100 μg/mL de poly-L-lysine (PLL) dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Lavez deux fois avec du PBS et laissez sécher l’assiette.
7. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et distribuez 200 μL/puits dans les plaques à fond rond à 96 puits recouvertes de PLL à l’aide d’une pipette multicanaux.
8. Transférez la plaque dans l’appareil d’imagerie automatisé à l’intérieur d’un incubateur (37 °C, 5 % CO₂, 95 % d’humidité).
9. Connectez-vous au logiciel d’acquisition, sélectionnez Planifier l’acquisition | Lancer Ajouter un navire | Scanner selon le calendrier | Créer un navire : Nouveau.
10. Sélectionnez le type de balayage : Sphéroïde. Sélectionnez les canaux d’intérêt : Phase + Fond clair (pour suivre la croissance des sphéroïdes), Vert (pour suivre le signal tumoral, temps d’acquisition 300 ms) et Rouge (pour suivre l’apoptose, temps d’acquisition 400 ms).
    1. Sélectionnez le grossissement souhaité : 10x.
    2. Choisissez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir. Sélectionnez la position des puits à imager. Entrez la description de l’expérience : nom, type de cellules, nombre de cellules.
11. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Différer l’analyse à plus tard. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la chronologie et sélectionnez l’option Définir l’intervalle du groupe de balayage sélectionné,puis Ajouter des numérisations toutes les 4 h et Pour un total de 24 h. Réglez l’heure de démarrage souhaitée (au moins 1 h après l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé).
12. Vérifiez tous les 2 jours la croissance des sphéroïdes en vous connectant au logiciel d’imagerie.
    1. Choisissez l’option Afficher les numérisations récentes et double-cliquez sur l’expérience souhaitée. Sélectionnez Fond clair dans le panneau des canaux d’image, puis utilisez l’outil Mesurer les caractéristiques de l’image pour mesurer le diamètre des sphéroïdes. Il faut 6 jours pour qu’un sphéroïde atteigne la taille souhaitée : 0,5 mm de diamètre. Ajouter 50 μL de milieu RPMI complet par puits au jour 4 pour limiter l’effet d’évaporation du milieu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Numéro de lot : RNBG7037
75 cm² flacons de surface de croissance	VWR	430639	Numéro de lot : 2218002
75 cm² flacons de surface de croissance	VWR	Référence 734-2705	Numéro de lot : 3718006
Trypsine-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Numéro de lot : SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Technologie du vivant (Gibco)	Référence 21875-091	Numéro de lot : 1926384
Gentamicine	Thermo Fischer	15750060	Numéro de lot : 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4 %	Thermo Fischer	15250061	Numéro de lot : 1886513
96 plaque de puits, fond rond	VWR	734 à 1797	Numéro de lot : 33117036
X-VIVO 15 avec Gentamicine L-Gln, Rouge Phénol, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Numéro de lot : 8MB036
Réservoir de réactifs	VWR	Référence 89094-672	Numéro de lot : 89094-672
tubes de 15 mL	VWR	734-1867	Numéro de lot : 19317044
Sérum de bovin fœtal	Gibco	10500064	Numéro de lot : 08Q3066K
HCT 116 Ligne de carcinome colorectal	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience