Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires : une méthode de culture cellulaire tridimensionnelle (3D)

1. Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires de cancer colorectal

1. Laver HCT 116 (transduit de manière stable pour exprimer les monocouches cellulaires du groupe de différenciation 19 (CD19) et de la protéine de fluorescence verte (GFP)) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 5 mL pour un flacon de 25 cm² ou 10 mL pour un ballon de^{75 cm 2}). Ajouter la trypsine (0,5 mL pour une fiole de 25 cm² ou 1 mL pour une fiole de 75 cm²) et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
2. Vérifier le décollement cellulaire au microscope et neutraliser l’enzyme de dissociation cellulaire à l’aide d’un milieu complet du Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10 % de FCS + gentamycine ; 10 mL pour une fiole de 25 cm² ou 20 mL pour une fiole de 75 cm²).
3. Suspension de la cellule de centrifugation à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension en pipetant de haut en bas plusieurs fois avec 5 mL de milieu RPM1 1640 complet.
4. Comptez les cellules à l’aide de l’exclusion du bleu Trypan sur un compteur de cellules compatible.
5. Suspension cellulaire de centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans un milieu RPMI pour obtenir 5 x 10³cellules/mL.
6. Enduire une plaque à fond rond de 96 puits avec 100 μL/puits de 100 μg/mL de poly-L-lysine (PLL) dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Lavez deux fois avec du PBS et laissez sécher l’assiette.
7. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et distribuez 200 μL/puits dans les plaques à fond rond à 96 puits recouvertes de PLL à l’aide d’une pipette multicanaux.
8. Transférez la plaque dans l’appareil d’imagerie automatisé à l’intérieur d’un incubateur (37 °C, 5 % CO₂, 95 % d’humidité).
9. Connectez-vous au logiciel d’acquisition, sélectionnez Planifier l’acquisition | Lancer Ajouter un navire | Scanner selon le calendrier | Créer un navire : Nouveau.
10. Sélectionnez le type de balayage : Sphéroïde. Sélectionnez les canaux d’intérêt : Phase + Fond clair (pour suivre la croissance des sphéroïdes), Vert (pour suivre le signal tumoral, temps d’acquisition 300 ms) et Rouge (pour suivre l’apoptose, temps d’acquisition 400 ms).
    1. Sélectionnez le grossissement souhaité : 10x.
    2. Choisissez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir. Sélectionnez la position des puits à imager. Entrez la description de l’expérience : nom, type de cellules, nombre de cellules.
11. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Différer l’analyse à plus tard. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la chronologie et sélectionnez l’option Définir l’intervalle du groupe de balayage sélectionné,puis Ajouter des numérisations toutes les 4 h et Pour un total de 24 h. Réglez l’heure de démarrage souhaitée (au moins 1 h après l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé).
12. Vérifiez tous les 2 jours la croissance des sphéroïdes en vous connectant au logiciel d’imagerie.
    1. Choisissez l’option Afficher les numérisations récentes et double-cliquez sur l’expérience souhaitée. Sélectionnez Fond clair dans le panneau des canaux d’image, puis utilisez l’outil Mesurer les caractéristiques de l’image pour mesurer le diamètre des sphéroïdes. Il faut 6 jours pour qu’un sphéroïde atteigne la taille souhaitée : 0,5 mm de diamètre. Ajouter 50 μL de milieu RPMI complet par puits au jour 4 pour limiter l’effet d’évaporation du milieu.