drosophile Dissection du disque imaginal larvaire : une méthode pour observer le développement des épithéliums

Résumé

Source : Morimoto, K. et Tamori, Y. Induction et diagnostic des tumeurs chez les épithéliums du disque imaginal de la drosophile. J. Vis. Exp. (2017).

Lors de la coloration des disques imaginaux de la drosophile, une dissection grossière est souvent effectuée où les disques sont exposés mais restent attachés au corps. Une fois colorés, les disques d’intérêt sont isolés et montés. L’exemple de protocole illustre une procédure de dissection et de montage du disque imaginal de l’aile.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Morimoto et Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissection des larves

1. Prélever les larves errantes du troisième stade à l’aide d’un bâton en bois ou d’une pince émoussée, les génotyper à l’aide de marqueurs fluorescents appropriés (p. ex., EGFP) sous un microscope stéréoscopique à fluorescence et les placer dans une boîte de dissection avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate).
2. Laver les larves dans du PBS en pipetant à l’aide de pipettes de transfert en plastique de 2 ml.
3. Pincez le centre de la larve avec une pince et déchirez le corps en deux avec l’autre pince.
4. Pincez le crochet buccal de la moitié antérieure avec une pince et poussez la bouche vers le corps avec l’autre pince pour retourner le corps.
5. Retirez les matériaux inutiles tels que les glandes salivaires ou les corps adipeux à l’aide d’une pince.

2. Fixation et coloration des anticorps

1. Transvasez la moitié antérieure disséquée du corps larvaire (y compris les disques des ailes imaginales) dans un tube en plastique de 1,5 mL et fixez dans 1 mL de solution Fix (formaldéhyde à 4 % dans du PBS) pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité avec une rotation douce.
   prudence: Le formaldéhyde est toxique et a un potentiel cancérigène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau.
   REMARQUE : Dans cette partie, toutes les étapes se déroulent sur un nutator à température ambiante dans l’obscurité, sauf indication contraire.
2. Retirez la solution Fix et jetez-la. Lavez les mouchoirs avec 1 mL de PBT (0,3 % de Triton X-100 dans du PBS) trois fois pendant 15 minutes chacune.
3. Retirer le PBT et ajouter 1 mL de PBTG (0,2 % d’albumine sérique bovine et 5 % de sérum de chèvre normal dans le PBT) pour bloquer et nuter 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
4. Retirer le PBTG et ajouter une solution d’anticorps primaires convenablement diluée avec du PBTG (voir le tableau des matières) et nuter toute la nuit à 4 °C.
5. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver les mouchoirs avec 1 mL de PBT trois fois pendant 15 minutes chacune.
6. Retirer le PBT et ajouter une solution d’anticorps secondaires convenablement diluée avec du PBTG (1:400). Nuter pendant 2 h à température ambiante ou toute une nuit à 4 °C.
7. Retirer la solution d’anticorps secondaires et laver les mouchoirs avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacune.
8. Pour colorer la F-actine, retirer le PBT et ajouter une solution de phalloïdine convenablement diluée dans du PBS (1:40). Nuter ensuite pendant 20 min. Retirer la solution de phalloïdine et laver les mouchoirs avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacune.
9. Pour contre-colorer l'ADN nucléaire, éliminer le PBT et ajouter une solution de DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) (0,5 μg/mL de DAPI dans du PBS). Puis nuter 10 min.
   prudence: Le DAPI a un potentiel cancérigène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau.
10. Retirer la solution de DAPI et laver les mouchoirs avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacune.
11. Rincer une fois dans 1 mL de PBS pendant 10 min à température ambiante.
12. Retirez le PBS et ajoutez 500 μL de glycérol à 100 % comme support de prémontage.

3. Montage sur lames de microscope

1. Placez les tissus colorés sur une lame de microscope à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 2 ml.
2. Transférez les tissus dans des gouttes de support de montage sur une autre lame de microscope à l’aide d’une pince.
3. Maintenez l’extrémité du tissu disséqué à l’aide d’une pince et retirez les disques antennaires du cerveau et de l’œil avec l’autre pince.
   REMARQUE : Gardez les cerveaux disséqués pour les placer près des disques imaginaux de l’aile. Le cerveau agit comme une plate-forme empêchant la lamelle d’écraser les disques imaginaux de l’aile.
4. Pour isoler l’aile, les disques imaginaux maintiennent l’extrémité du tissu disséqué à l’aide d’une pince, grattent doucement la paroi du corps et arrachent les disques avec l’autre pince><. REMARQUE : S’il est difficile de trouver des disques imaginaux alaires, pelez la trachée de la face postérieure vers la face antérieure. Les disques imaginaux de l’aile collent à la trachée.
5. Couvrez délicatement les disques imaginaux avec une lamelle et scellez-les avec du vernis à ongles ; conservez à 4 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	Référence 168-11805
Formaldéhyde	Wako	Référence 064-00406
albumine sérique bovine	sigma	A7906
sérum de chèvre normal	sigma	Réf. G6767
support de montage, Vectashield	Laboratoires Vecteurs	H-1000
DAPI	sigma	D9542
souris-anti-Dlg 4F3	Etudes développementales Hybridoma Bank	4F3 anti-disques large, RRID :AB_528203	diluer dans PBTG, 1:40
souris-anti-MMP1	Etudes développementales Hybridoma Bank	3A6B4, RRID : AB_579780	3 mélangés 1:1:1 et dilués dans PBTG, 1:40
souris-anti-MMP1	Etudes développementales Hybridoma Bank	3B8D12, RRID :AB_579781	3 mélangés 1:1:1 et dilués dans PBTG, 1:40
souris-anti-MMP1	Etudes développementales Hybridoma Bank	5H7B11, RRID :AB_579779	3 mélangés 1:1:1 et dilués dans PBTG, 1:40
souris-anti-atubuline	Etudes développementales Hybridoma Bank	AA4.3, RRID :AB_579793	diluer dans le PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloïdine	Sondes moléculaires	Référence A22283	diluer dans PBS, 1:40
anticorps IgG anti-souris chèvre, Alexa Fluor 546	Sondes moléculaires	A11030	diluer dans le PBTG, 1:400
Souches de mouches
sd-gal4	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 8609	recombiné avec UAS-EGFP
upd-Gal4	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 26796	recombiné avec UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Centre ARNi de la drosophile à Vienne	Réf. 51247
UAS-scrib-RNAi	Centre ARNi de la drosophile à Vienne	#105412
UAS-RasV12	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 64196
UAS-Yki3SA	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 28817
hsFLP	Centre de stock de drosophile de Bloomington	#6
Act>CD2>GAL4 (GAL4 rabattable)	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 4780	recombiné avec UAS-EGFP
UAS-EGFP	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 5428	Chromosome X
UAS-EGFP	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 6658	troisième chromosome
DUS-Dicer2	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 24650	deuxième chromosome
DUS-Dicer2	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Réf. 24651	troisième chromosome
vkg-GFP	Morin et al., 2001		Piège à protéines GFP