Ce protocole est un extrait de Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).
1. Solutions et préparation des matériaux
- Préparez les solutions suivantes.
- Prepare Serum Supplemented Medium (SSM) : Milieu de drosophile de Schneider complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine.
- Préparez des aliquotes de l’enzyme trypsine 1x (p. ex., TrypLE Express Enzyme) et conservez-les à température ambiante.
- Préparez des aliquotes de papaïne [50 U/mL] (conservées à -20 °C et décongelées une seule fois).
- Préparez 1x solution saline tampon phosphate (PBS, conservée à température ambiante).
- Préparez plusieurs pointes de pipette arrondies à la flamme pour la dissociation physique des glandes accessoires.
REMARQUE : Utilisez des embouts à faible rétention pour manipuler les presse-étoupes accessoires, car ils ont tendance à adhérer au plastique non traité. Le processus d’arrondi à la flamme réduit l’ouverture de la pointe et lisse les bords de la pointe. Cela garantit une dissociation efficace après la digestion de la peptidase sans cisailler les membranes cellulaires.
- Coupez une pointe de 200 μL avec une lame tranchante et passez-la doucement sur une flamme pour arrondir sa pointe de sorte que l’ouverture soit plus large mais lisse pour la manipulation lors de l’étape 2.7.
- Rétrécissez l’ouverture de plusieurs pointes de 1 000 μL en passant l’ouverture de la pointe près d’une flamme pendant moins d’une seconde. Tournez légèrement la pointe pour éviter de trop fondre ou de se boucher. Triez les pointes faites de plus étroite à plus large. Cela peut être fait en chronométrant la vitesse d’aspiration. Essayez de dissocier un échantillon à petite échelle d’AG pour tester l’efficacité des pointes les plus étroites.
REMARQUE : Ces pointes sont essentielles pour l’agitation mécanique. Des pointes de pipette arrondies à la flamme de qualité permettent une dissociation complète tout en préservant la viabilité cellulaire. En tant que tels, ces pointes sont soigneusement lavées à l’eau à la fin de la procédure pour être réutilisées. Cela permet une dissociation reproductible au jour le jour.
2. Dissection des glandes accessoires
- Mettez 20 à 25 drosophiles mâles dans un plat en verre sur de la glace.
- Disséquer 1 mâle en MSS. Retirez son appareil reproducteur et dégagez la paire de glandes accessoires de tous les autres tissus à l’exception du canal éjaculateur.
REMARQUE : Retirez les testicules car les spermatozoïdes libérés peuvent créer des amas et perturber le processus de dissociation. Retirez le bulbe éjaculateur, ce qui rend la manipulation difficile lorsqu’il flotte.
- À l’aide d’une pince, transférez les presse-étoupes accessoires sur une plaque de verre remplie de SSM à température ambiante. Répétez les étapes 2.2-2.3 20 fois pour obtenir un lot de 20 paires de glandes dans SSM.
REMARQUE : Ces étapes seront réalisées en 15 à 20 min. Les AG doivent avoir l’air sains et les mouvements péristaltiques de la couche musculaire autour des glandes doivent être visibles. La GFP peut être surveillée à l’aide d’un microscope fluorescent.
- Transférez les presse-étoupes dans 1x PBS pour un lavage de 1 à 2 minutes à température ambiante.
REMARQUE : Pour une meilleure dissociation, il est impératif de rincer les glandes avec du PBS. La durée de cette étape doit toutefois être limitée car les cellules montrent des signes de stress dans le PBS ; les cellules secondaires dissociées du PBS gonflent et meurent rapidement.
- Diluer 20 μL de papaïne [50 U/mL] dans 180 μL de 1x l’enzyme trypsine pour obtenir la solution de dissociation (pour augmenter ou diminuer, garder 9 μL d’enzyme trypsine et 1 μL de papaïne pour chaque mâle). À l’aide d’une pince, transférez les presse-étoupes accessoires vers cette solution.
- Isolez l’extrémité des glandes accessoires (contenant les cellules secondaires) de la partie proximale. À l’aide d’une pince fine, pincez fermement le milieu d’un lobe glandulaire et coupez avec la pointe pointue d’une deuxième pince. Retirez la partie proximale des glandes accessoires et le canal éjaculateur pour améliorer la dissociation et réduire le temps de tri cellulaire.
REMARQUE : La dissection de la partie distale de 20 paires de glandes prendra 15 à 20 min et la digestion par les peptidases commencera ainsi à température ambiante.
- Une fois que toutes les pointes de presse-étoupes ont été disséquées, transférez-les dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de pipette spéciale de 200 μL préparée à l’étape 1.2.1. Il doit être large, arrondi et humide avant de manipuler les presse-étoupes.
REMARQUE : Pour pipeter le tissu des glandes accessoires, les pointes doivent toujours être pré-humidifiées avec une solution appropriée (enzyme trypsine ou SSM, conservez un tube de chaque à cet effet). Rincez soigneusement les pointes entre les échantillons pour éviter toute contamination.