Drosophila melanogaster Le curage ganglionnaire ovarien : une technique de préparation tissulaire ex vivo

Dans cet article

Résumé

Source : Parker, D. J., et al. Étude de la structure et de la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit l’anatomie générale de l’ovaire de la drosophile et présente une méthode de dissection des ovaires pour l’imagerie en direct ou fixe.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation de la drosophile (les outils nécessaires sont décrits dans Figure 1A)

Pour l’une ou l’autre des expériences décrites, prélever des drosophiles (maintenues à température ambiante ou à 25 °C) dans les 5 jours suivant l’éclosion et les placer dans un flacon rempli de 5 à 7 ml de nourriture pour drosophile (voir le tableau des matières), avec pas plus de 25 mouches dans chaque flacon ; maintenir un rapport femelle/mâle de 2:1.
Saupoudrez une petite quantité de levure granulée pour stimuler la production d’œufs de drosophile. Effectuer une manipulation expérimentale dans un délai de 2 à 4 jours.

2. Dissection des ovaires de la drosophile (les outils nécessaires sont décrits dans Figure 1A)

Réchauffer le milieu de dissection des insectes (voir le tableau des matières) à la température ambiante, 25 °C. Remplir trois puits d’un plat de dissection en verre à huit puits, avec 200 μL de milieu dans chaque puits.
Anesthésier la drosophile avec du CO₂ en plaçant l’aiguille de la sarbacane sous le bouchon du flacon. Placez-les sur un coussin anti-mouches. À l’aide d’un microscope de dissection, triez 5 femelles et placez-les dans le premier puits de la boîte de dissection. Manipulez une drosophile à la fois lors de la microscopie en direct.
Tout en regardant à travers l’oculaire du microscope de dissection, sectionnez le thorax de l’abdomen à l’aide de deux paires de pinces. À l’aide de la pince, transférez soigneusement les abdomens dans le deuxième puits du plat.
Utilisez une paire de pinces pour maintenir l’abdomen à l’extrémité postérieure et poussez lentement les ovaires (avec le reste du contenu abdominal) avec l’autre paire de pinces. Si cette tentative échoue, retirez soigneusement l’exosquelette abdominal en insérant la pince dans l’extrémité antérieure pour libérer les ovaires.
À l’aide de la pince, tenez un ovaire individuel par l’extrémité postérieure opaque (c’est-à-dire les œufs remplis de jaune et à un stade avancé) et déplacez-le soigneusement vers le troisième puits de la boîte pour le taquiner afin de le traiter pour la microscopie en direct ou pour le fixer afin d’effectuer une immunomarquage.
Taquinez soigneusement la gaine protectrice autour des ovaires en balayant légèrement une aiguille à taquiner de l’extrémité postérieure à l’extrémité antérieure de chaque ovaire tout en la tenant par l’extrémité postérieure à l’aide d’une paire de pinces.
REMARQUE : Pour minimiser les dommages lors du taquinage, pliez la pointe de l’aiguille et zoomez sur chaque ovaire en augmentant le grossissement du microscope (Figure 1A). Les taquineries doivent être suffisamment efficaces pour briser la gaine, mais elles doivent également être faites avec soin pour préserver l’intégrité des ovaires.

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Résultats

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Figure 1 : Plan expérimental et préparation. (A) Outils utilisés dans les méthodes décrites : A. Fiole de mouches ; B. Milieu de dissection des insectes ; C. Paraformaldéhyde ; D. Brosse à mouches ; E. Plat de dissection ; F. Verre de protection ; G. Tube à microfuge. H. Plat à fond de verre ; I. Diapositive en verre ; J. Micropipette de 1 000 μL ; K. Micropipette de 200 μL ; L. M...