Dissection du tubule de Malpighian d’une mouche adulte : isolement d’un organe osmorégulateur et excréteur

Résumé

Source : Rossano, A. J. et Romero, M. F. Quantification optique du pH intracellulaire chez l’épithélium du tubule de Malpighian chez Drosophila melanogaster avec un indicateur de pH génétiquement codé fluorescent. J. Vis. Exp. (2017).

Cet article décrit la dissection des tubules antérieurs de Malpighi (MT) d’une mouche drosophile femelle et un exemple de protocole de Rossano et al. (2017) dans lequel les MT sont préparés pour l’imagerie en direct dans une chambre de perfusion.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Rossano et Romero, Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation des lames de poly-L-lysine

1. Tracez une bordure de 40 x 20 mm avec un stylo PAP hydrophobe autour du haut des lames standard de 75 x 25 mm et laissez sécher pendant 15 minutes à RT. Utilisez de grandes lamelles si les lames ne sont pas compatibles avec l’optique d’imagerie.
2. Transvaser 2 mL de solution mère de poly-L-lysine à 0,01 % (PLL) sur chaque lame et laisser reposer 1 h à RT.
3. Retirez l’excès de PLL à l’aide d’une pipette. Conservez la solution dans un flacon conique de 50 ml pour une utilisation future. Conserver à 4 °C.
4. Aspirez toute solution restante avec une conduite de vide. Passez la conduite de vide sur toute la surface de la lame pour vous assurer qu’il ne reste aucune solution sur les diapositives.
5. Mettez les lames de côté pendant 1 heure supplémentaire à RT avant de les utiliser. Conservez les diapositives au sec à RT jusqu’à 1 mois dans un livre de diapositives standard.

2. Préparation du plat de dissection et des tiges de verre

1. Ajouter 0,5 mL d’agent de durcissement en élastomère à 4,5 mL de base en élastomère dans une boîte de Pétri en polystyrène de 35 x 10 mm à RT pour obtenir une profondeur de 5 mm. Mélanger avec une pointe de pipette jetable. Laisser l’élastomère durcir O/N à RT.
   REMARQUE : L’élastomère doit être transparent et exempt de bulles. L’élimination des bulles peut être facilitée en conservant les plaques d’élastomère dans un bocal sous vide pendant 10 à 15 minutes après le versement.
2. Tenez une tige de verre de 5 mm de diamètre entre les mains et faites fondre le centre de la tige au-dessus d’un bec Bunsen allumé tout en écartant les extrémités. Au fur et à mesure que le verre fond, tirez plus rapidement pour produire un arbre mince (0,1 mm) et effilé (Figure 1).
   REMARQUE : Un angle de 45 ° au niveau de la tige est souvent utile dans la manipulation des tubules. Cela peut être réalisé en abaissant une main pendant que la tige est tirée (voir Figure 1).
3. Cassez la tige mince au milieu avec le côté émoussé d’une lame de rasoir en acier au carbone à un seul tranchant. Inspectez l’extrémité mince de la tige sous une lunette de dissection pour vous assurer que la rupture est propre.

3. Dissection des tubules de Drosophile antérieurs adultes

1. Rassemblez le plat de dissection et la tige de verre retirée de la section 2, une lame enduite de PLL de la section 1, un séparateur de puits de perfusion adhésive, de la graisse sous vide, une bande de 4 x 2 po de film d'étanchéité, 2 paires de pinces fines #5 et 40 mL d'aliquotes de milieu Schneider glacé et de RT iPBS.
2. Étalez de la graisse sous vide sur le ruban d’étanchéité et appuyez sur le séparateur de puits de perfusion adhésive sur le ruban pour enduire le fond de graisse. Décollez le séparateur de puits de perfusion d’adhésif et placez-le, côté gras vers le bas, sur une lame enduite de PLL. Retirez le séparateur de puits de perfusion pour laisser les puits d’échantillon individuels tracés dans de la graisse hydrophobe.
3. Placez 200 μL de RT iPBS dans le puits encerclé de graisse sur la lame revêtue de PLL et déplacez la lame sous le stéréoscope.
4. Placez les mouches UAS-pHerry/capaR-GAL4 dans un flacon de mouches vide et anesthésiez-les sur de la glace pendant 10 min
   REMARQUE : Cette méthode d’anesthésie, contrairement au CO₂, permet de s’assurer que les mouches ne se déshydratent pas.
5. Versez du médium Schneider glacé dans la boîte de dissection et utilisez des pinces fines pour transférer une seule mouche femelle anesthésiée dans la boîte sous un stéréoscope de dissection.
6. Tenez la mouche par le thorax à l’aide d’une pince et utilisez l’autre pour saisir doucement l’arrière de l’abdomen. Ouvrez le postérieur de la mouche à l’aide de la pince en mouvements courts et délibérés. Une fois que l’intestin postérieur est visible, saisissez l’extrémité distale et libérez l’intestin et les MT des trachéoles sous-jacentes en éloignant l’intestin postérieur du corps par des tiraillements brefs et répétitifs.
   REMARQUE : Les MT antérieurs et postérieurs seront visibles à l’endroit où ils rencontrent la jonction de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur à travers l’uretère. La première paire de MT à être libre sera probablement les tubules postérieurs car ils entourent l’intestin postérieur. Ceux-ci peuvent être ignorés (Figure 2A).
7. Pincez les MT antérieurs au niveau de l’uretère avec des pinces fines une fois que la deuxième série de MT est libre de l’abdomen. Cela séparera les MT antérieurs de l’intestin et fermera l’uretère.
8. Prélevez les MT antérieurs libres avec la tige de verre tirée en glissant la tige sous l’uretère de sorte que les tubules tombent de chaque côté. Soulevez les MT tout droit hors de la solution.
9. Tournez la tige de verre de manière à ce que les MT et l’uretère adhèrent à la face inférieure de la tige et abaissez l’uretère directement sur la lame. Fixez l’uretère et scellez les extrémités distales des MT en appuyant sur l’uretère sur la lame de verre (Figure 2B). Ne manipulez pas les MT plus que nécessaire. Les MT doivent flotter dans la solution avec l’uretère ancré à la lame.
10. Utilisez l’extrémité fine de la tige de verre pour balayer doucement chaque tubule sur la surface de la glissière. Placez la tige contre la glissière pour éviter d’écraser le tubule et faites glisser la tige sur le dessus du tubule, en se déplaçant distale à proximale, pour fixer toute la longueur de chaque tubule à la surface de la lame revêtue de PLL (Figure 2C).
11. Replacez le séparateur de puits de perfusion adhésif sur la lame pour former un petit puits rempli de liquide sur le tubule monté.
12. Placez l’échantillon sur la platine du microscope. Positionnez les capillaires d’entrée et de sortie sur l’ouverture d’entrée et de sortie du puits de perfusion, respectivement.
    REMARQUE : Le séparateur de puits peut être laissé de côté si une chambre de perfusion ouverte est souhaitée. Dans ce cas, les capillaires d’entrée et de sortie peuvent être alignés sur les côtés opposés d’un puits d’imagerie.

Résultats

Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	Réf. P4832	Conserver à 4 °C, peut être réutilisé.
Couvercles de chambre de perfusion adhésive, taille de l’adhésif 1 mm, diamètre × épaisseur de la chambre 9 mm × 0,9 mm, diamètre des orifices 1,5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Peut être remplacé au besoin pour correspondre au système de perfusion.
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Adhésifs Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Supports à souder Helping Hands	Outils de fret portuaire	Référence 60501	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Le médium de Schneider	Fisher Scientific	21720024	Conserver à 4 °C dans des aliquotes stériles.
#5 Pince en acier inoxydable	Outils scientifiques fins	Référence 11252-20	Peut être remplacé en fonction du confort de l’expérimentateur.
Boîte de Pétri en polystyrène 35 x 10 mm	Corning Sciences de la vie	Fisher Scientific 08-757-100A	La marque et la taille exactes n’ont pas d’importance.
Lames de microscope 75 x 25 mm	Corning Sciences de la vie	Référence 2949-75X25	La marque et la taille exactes peuvent varier tant que les puits de perfusion sont compatibles.
Verre capillaire borosilicaté filimenté, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, épaisseur 0,32 mm	Warner Instruments	Référence 64-0796	Filiment non nécessaire, le verre peut être remplacé pour s’adapter au tube de perfusion et aux puits de perfusion.
Graisse silicone sous vide	Sigma-Aldrich	Z273554	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Tiges de verre, 5 mm de diamètre	delphiglass.com	Référence 9198	La taille exacte est une préférence personnelle, plusieurs fournisseurs disponibles
Stylo hydrophobe PAP	Sigma-Aldrich	Z377821	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Film d’étanchéité	Sigma-Aldrich	P7668	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Tube Falcon de 15 mL	BD Faucon	352096	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Tube Falcon de 50 mL	BD Faucon	Référence 352070	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Dissection d’un stéréoscope	Zeiss	Découverte.V8	N’importe quel stéréoscope de dissection peut être utilisé.
UAS-pHerry transgénique Drosophila melagnogaster	Disponible chez Romero Lab		Première publication : Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 ligne de pilote Drosophila melagnogaster	Disponible chez Romero Lab		Première publication : Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 lignée pilote Drosophila melagnogaster	Disponible chez Romero Lab		Première publication : Sozen et al., 1997
Lame de rasoir en acier au carbone à un seul tranchant	Sciences de la microscopie électronique	Référence 71960	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Dossier de lames de microscopie	Fisher Scientific	16-04	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
bec Bunsen	Fisher Scientific	Tél. : 50-110-1231	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Flacons d’élevage de drosophile en polystène avec flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Des articles comparables peuvent être remplacés.
Seau à glace de laboratoire de 2,5 L	Fisher Scientific	Tél. : 07-210-129	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Pointes de pipette barrière de 200 μL	MidSci	AV200	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Pipette à volume variable de 200 μL	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.