Ce protocole est un extrait de Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).
1. Construction de la boîte d’essai de l’île
- Préparez un plateau fait d’un matériau robuste, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), pour contenir une couche d’eau (c’est-à-dire un bain). Assurez-vous que le matériau n’est pas blanc.
REMARQUE : Des dimensions de 40 x 35 x 2,5cm3 sont recommandées (Figure 1A).
- Préparez une boîte (42 x 38 x 25 cm3) faite d’un matériau robuste et transparent, comme le PMMA, à placer autour du bain pour éviter que les mouches ne s’échappent dans l’espace du laboratoire. Placez un trou (20 x 30 cm2) sur le côté latéral qui est suffisamment grand pour que l’expérimentateur puisse facilement manipuler les flacons avec des mouches et les déposer sur l’îlot (Figure 1A).
- Préparez une plate-forme surélevée de 10 x 15 x 2,5 cmde dimension 3, faite d’un matériau imperméable (PMMA ou plastique) étanche à l’eau.
REMARQUE : Cette plate-forme doit avoir une surface blanche uniforme pour assurer un bon contraste pour l’analyse d’images. La taille n’est pas nécessairement fixe, mais elle doit être suffisamment grande pour s’assurer que toutes les mouches atterrissent initialement sur la plate-forme et aient la chance de marcher dessus (Figure 1A).
- Fixez la plate-forme en la collant dans le bain ou en plaçant des poids ou d’autres objets lourds à l’intérieur de la boîte de plate-forme pour éviter les changements de position de la plate-forme pendant la séance expérimentale/de tournage.
2. Configuration logicielle requise et installation
- Installation d’un logiciel d’enregistrement d’images.
- Téléchargez un logiciel d’enregistrement d’images pour enregistrer la série d’images de l’île (voir la Table des matériaux) et installez le logiciel sur un ordinateur.
REMARQUE : Le logiciel d’enregistrement d’images décrit dans ce protocole n’est pris en charge que par Windows. Une alternative pour les autres utilisateurs a été ajoutée à la table des matériaux.
3. Préparation des mouches à tester dans l’essai sur l’île
- Prélever des mouches étagées pour chaque condition expérimentale sous anesthésie froide ou au dioxyde de carbone (CO2), comme décrit précédemment (sur une période de 1 à 2 jours).
- Préparez un minimum de 3 flacons d’échantillons par condition expérimentale, chacun contenant environ 15 mouches étagées. N’utilisez que des mouches avec des ailes intactes et qui sont d’âge et de sexe similaires.
REMARQUE : Pour les expériences décrites ici, 5 flacons d’échantillons contenant 15 mouches mâles des génotypes w- ; Actin-Gal4/+ (contrôle) et w- ; L’actine-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) a été collectée le jour de l’éclosion, âgée pendant 4 jours, et a été utilisée pour effectuer le test insulaire. L’ARNi, les souches témoins et le pilote Actin-gal4 ont été obtenus à partir d’une source commerciale (voir la table des matériaux).
- Laissez les mouches se rétablir pour éviter les effets des anesthésiques (au moins 1 jour en cas d’utilisation de CO2) avant de tester les mouches collectées dans le test de l’île à l’âge d’intérêt.
4. Configuration expérimentale
REMARQUE : Voir Figure 1B.
- Ajoutez de l’eau froide avec une petite quantité de savon dans le bac de bain et positionnez la plate-forme au milieu.
REMARQUE : Le savon diminue la tension superficielle de l’eau ; Les mouches qui touchent l’eau se noieront. Cela permet d’éviter un nombre croissant de mouches volant dans la boîte au cours de la progression de la session expérimentale.
- Placez la boîte transparente sur le dessus du plateau et éclairez la plate-forme par le haut à l’aide d’une lamp.
REMARQUE : L’éclairage de la plate-forme est principalement nécessaire pour assurer un bon contraste vidéo. Une lumière LED 12 V ordinaire convient pour cela.
- Placez la webcam directement au-dessus de la plate-forme (à l’extérieur de la boîte) et connectez-la à un ordinateur.
- Créez de nouveaux dossiers sur l’ordinateur pour stocker les différentes données expérimentales avant les expériences.
- Suivez la structure de l’exemple illustré dans Figure 2A pour créer les dossiers. Par exemple, si la conception de l’expérience nécessite de tester deux génotypes de cinq répétitions chacun, créez d’abord un dossier principal contenant la date de l’expérience. Dans le dossier principal, créez deux sous-dossiers (un par génotype). Dans les dossiers de génotype, créez cinq nouveaux sous-dossiers, un par replicate.
REMARQUE : Pour une analyse plus approfondie, il est essentiel que les séries d’images correspondant aux expériences individuelles soient enregistrées dans des dossiers avec des noms uniques.
5. Configuration des paramètres vidéo dans la section « Périphérique de capture » de l’interface
- Ouvrez le logiciel d’enregistrement d’images et, sous l’onglet « Capture », cliquez sur « Time-Lapse Images... » et sélectionnez la webcam appropriée comme « Périphérique de capture ».
- Placez une mouche morte sur l’île, ajustez les paramètres vidéo en cliquant sur la case « Paramètres vidéo ». Faites défiler les barres d’outils en ajustant la luminosité, le contraste et la couleur de manière à ce que la mouche morte apparaisse noire sur un fond blanc (Figure 2B). Une fois les réglages terminés, cliquez sur « OK ».
6. Configuration des paramètres d’enregistrement et de sauvegarde vidéo dans la section « Time-lapse » de l’interface
- Ajustez les paramètres dans la « Configuration vidéo Time-Lapse » pour enregistrer l’expérience en tant que fichier .avi. Cliquez sur « Parcourir... », sélectionnez le répertoire où le film sera stocké, définissez le nom de la vidéo, et appuyez sur « enregistrer ».
REMARQUE : Le fichier vidéo n’est pas utilisé pour la quantification des données ; Cependant, il peut être utile d’avoir une idée globale de l’expérience.
- Ajustez les paramètres dans la section « Time-Lapse Movie Setup ».
- Dans la boîte de compression, sélectionnez « Code Intel IYUV » pour la compression vidéo et choisissez « Prendre une image toutes les 0,1 seconde », avec le « Taux de lecture (images par seconde) : » à 10.
- Enregistrez la série chronologique de l’expérience sous forme d’images .bmp en cliquant sur « Avancé... », sélectionnez « Créer une image .bmp pour chaque image capturée ». Cliquez sur « Parcourir ». Sélectionnez le même répertoire dans la fenêtre « Pendant la capture vidéo AVI » (comme choisi à l’étape 6.1), cliquez sur « Ouvrir » et appuyez sur « Ok ».
REMARQUE : Notez que, pendant l’expérience, les trames sont stockées sous forme de fichiers .bmp (nécessaires à l’analyse des données). Le programme nomme les images comme « A » suivi du numéro correspondant à la séquence de capture d’image (par exemple, « A_number.bmp ») (Figure 2C). Enregistrez toujours les images appartenant à différentes expériences dans un nouveau dossier pour vous assurer que les séries d’images précédemment enregistrées ne seront pas écrasées. Sachez que les images ne sont pas automatiquement enregistrées dans le même dossier que le fichier vidéo, sauf si ce dossier est sélectionné sous « Parcourir... » en cliquant sur la case « Avancé ».
7. Essai insulaire et collecte de données
- Appuyez sur le bouton de démarrage dans l’interface d’image time-lapse du logiciel d’enregistrement d’images pour démarrer l’enregistrement.
- Tapotez 2 à 3 fois le flacon expérimental contenant des mouches (étape 3) pour vous assurer que les mouches sont au fond du flacon. Retirez rapidement le bouchon de la fiole et, d’un mouvement vigoureux, tapotez la fiole sur la plate-forme de sorte que toutes les mouches tombent sur la plate-forme en même temps (Figure 1C).
- Après environ 30 s, appuyez sur le bouton « Stop » pour arrêter l’enregistrement.
REMARQUE : Si toutes les mouches disparaissent de la plate-forme, l’enregistrement peut être arrêté plus tôt.
- Retirez à la main les mouches qui restent pendant 30 s sur la plate-forme après avoir arrêté l’enregistrement des images.
- Avant de procéder à l’enregistrement de l’expérience suivante, modifiez le répertoire cible pour les fichiers .bmp et les films (voir section 6).
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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