Ce protocole est un extrait de Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Préparation des aliments
- Pour l’entretien du stock et pour la croissance larvaire, utilisez un milieu de semoule de maïs contenant 3 % de levure en poudre, 10 % de saccharose, 9 % de semoule de maïs précuite, 0,4 % d’agar, appelé par la suite milieu de semoule de maïs (CM).
- Mettez 30 g de levure dans 100 ml d’eau du robinet, portez à ébullition et laissez bouillir pendant 15 min.
- Séparément, bien mélanger 90 g de semoule de maïs précuite, 100 g de sucre et 4 g de gélose dans 900 ml d’eau du robinet.
- Portez la solution à ébullition, baissez le feu et laissez cuire 5 minutes en remuant continuellement.
- Au bout de 5 minutes, ajoutez la solution de levure chaude et laissez mijoter encore 15 min.
- Éteignez la source de chaleur et laissez la solution refroidir à environ 60 °C.
- Ajouter 5 ml/L de 4-hydroxybenzoate de méthyle à 10 % dans de l’éthanol, bien mélanger et laisser reposer pendant 10 min
REMARQUE : Faites attention à la quantité de 4-hydroxybenzoate de méthyle, étant donné qu’une forte concentration de fongicide pourrait être mortelle pour les larves.
- Répartir le milieu dans des flacons/bouteilles : 8 mL dans chaque flacon anti-mouches (25 mm x 95 mm), 3 mL dans chaque flacon anti-mouches (22 mm x 63 mm) et 60 mL dans chaque flacon anti-mouches (250 mL).
- Couvrez les flacons d’une étamine et laissez-les sécher à température ambiante pendant 24 h avant de les ranger.
- Calibrer expérimentalement la consistance et l’hydratation correctes de la MC en modifiant soit la quantité de gélose utilisée et/ou les temps de refroidissement/séchage.
REMARQUE : les flacons débranchés, emballés et emballés sont stables pendant environ 15 jours à 4 °C.
- Pour la drosophile adulte, utilisez un milieu contenant 10 % de levure en poudre, 10 % de saccharose, 2 % d’agar, appelé par la suite milieu adulte (AM).
- Mélangez 10 g de levure en poudre, 10 g de saccharose, 2 g d’agar-agar dans 100 ml d’eau distillée.
- Portez ce mélange à ébullition deux fois, à 3 minutes d’intervalle, ou jusqu’à ce que la gélose soit dissoute, à l’aide d’un micro-ondes.
- Une fois que la solution a refroidi à 60 °C, ajouter 5 mL/L de 4-hydroxybenzoate de méthyle à 10 % dans de l’éthanol, bien mélanger et distribuer dans des flacons (10 mL par flacon).
- Couvrez les flacons d’une étamine et laissez-les sécher à RT pendant 24 h avant de les ranger.
REMARQUE : les flacons débranchés, emballés et emballés sont stables pendant environ 15 jours à 4 °C.
2. Dosage de l’EDC de la drosophile
- Préparez une solution mère appropriée en dissolvant le PE sélectionné dans le solvant approprié. Pour l’EE2 (poids moléculaire 296,403), dissoudre 1,48 g dans 10 mL d’éthanol à 100 % pour obtenir une solution mère à 0,5 M et la conserver à -80 °C
prudence: Les perturbateurs endocriniens sont considérés comme des polluants environnementaux et des précautions doivent être prises lors de leur manipulation.
- Diluer la solution mère d’EE2 dans de l’éthanol à 10 % dans de l’eau (v/v) afin d’obtenir une solution de 100 mM. Effectuer les dilutions suivantes (0,1 mM, 0,5 mM et 1 mM) dans les aliments en CM, en commençant par la concentration la plus faible et en utilisant la même concentration finale de solvant pour chaque groupe de traitement. Pour les flacons de contrôle, utilisez le même volume de solvant seul.
REMARQUE : il est recommandé de maintenir la concentration finale du solvant aussi basse que possible, en gardant à l’esprit que la concentration finale d’éthanol ne doit pas dépasser 2 % dans les aliments contre les mouches.
- Ajouter la solution contenant la bonne dilution de l’EDC sélectionné à l’aliment à base de semoule de maïs avant la solidification, bien mélanger avec un robot culinaire, verser 10 mL dans des flacons, couvrir de gaze de coton et laisser sécher à RT pendant 16 h avant d’utiliser.
REMARQUE : utilisez ce milieu immédiatement après sa préparation.
- Pour l’élevage des adultes, préparer différentes solutions d’EE2 de travail (10 mM, 50 mM et 100 mM, respectivement) dans de l’éthanol à 10 % dans de l’eau (v/v) et superposer 100 μL de chacune sur la surface de l’AM, afin d’obtenir la concentration souhaitée de l’EE2 (0,1 mM, 0,5 mM et 1 mM). Pour le contrôle, utilisez le même volume de solvant seul.
NOTE : alternativement, ajoutez la solution contenant la bonne dilution de l’EDC sélectionné à une petite quantité d’AM dans un tube conique de 50 mL, agitez soigneusement et stratifiez 1 mL de celui-ci sur la surface des flacons AM.
- Couvrez les flacons avec de la gaze de coton, laissez sécher à RT pendant 12 à 16 h sous une légère agitation et utilisez-les immédiatement.
REMARQUE : le processus de séchage doit être ajusté expérimentalement car il dépend de l’humidité ambiante.
3. Élevage des mouches
- Utiliser une souche isogénique robuste, telle que l’Oregon R, maintenue par plusieurs générations en laboratoire.
- Conservez les mouches dans un incubateur humidifié à température contrôlée, avec une lumière naturelle de 12 h : 12 h d’obscurité photopériode à 25 °C dans des flacons contenant de la nourriture CM.
- Dans chaque essai, utilisez des flacons à RT.
4. Protocole de durée de vie
- Installer 20 flacons de mouches avec 8 femelles et 4 mâles et les loger à 25 °C en CM (10 mL chacun).
- Après 4 jours, jetez les mouches et remettez les flacons dans l’incubateur.
NOTE : ces mouches peuvent être utilisées pour recommencer afin d’obtenir d’autres cohortes de mouches synchronisées selon l’âge.
- En fin d’après-midi du jour 9, retirez toutes les mouches nouvellement fermées des flacons et remettez les flacons dans l’incubateur.
NOTE : quelques adultes devraient commencer à se fermer dès le neuvième jour ; L’élimination de ces mouches permet de collecter un maximum de mouches synchronisées, évitant ainsi la sélection négligente des mouches de levée précoce.
- 16 à 24 h plus tard, transférez les mouches adultes (âgées de 1 jour) des deux sexes dans quatre groupes de bouteilles de 250 mL contenant des aliments AM complétés par trois concentrations différentes de PE et un avec le solvant seul. Si nécessaire, récupérez un autre lot le lendemain.
- Maintenez les mouches à 25 °C pendant 2-3 jours pour leur permettre de s’accoupler.
NOTE : le jour du transfert vers les flacons alimentaires du matin correspond au premier jour de l’âge adulte.
- Après deux ou trois jours, triez chaque cohorte de mouches par sexe en deux groupes sous anesthésie légère au CO2. Subdivisez au hasard chaque sexe en cinq flacons par traitement à une densité de 20 individus par flacon, jusqu’à ce qu’il y ait trois répétitions de 5 flacons parallèles pour chaque sexe par traitement.
REMARQUE : Travaillez avec de petits groupes de mouches afin de prévenir d’éventuels problèmes de santé à long terme dus à une longue durée d’exposition au CO2.
- Préparez une feuille de calcul de la durée de vie dans laquelle le nombre de mouches mortes est soustrait du nombre de mouches survivantes au transfert précédent, de manière à obtenir automatiquement le nombre de survivants à chaque transfert.
- Transférez les mouches dans de nouveaux flacons contenant la nourriture correspondante tous les 3 jours en même temps et vérifiez qu’il n’y a pas de mort.
NOTE : le transfert doit avoir lieu sans anesthésie qui pourrait avoir un effet négatif à long terme sur la longévité des mouches.
- À chaque transfert, notez l’âge des mouches et le nombre de mouches mortes.
NOTE : le nombre de mouches survivantes est automatiquement calculé dans le tableur mais il est recommandé de le vérifier visuellement. Les mouches qui s’échappent accidentellement ou qui meurent pendant le transfert ne doivent pas être prises en compte. Attention à ne pas compter deux fois les mouches mortes transportées vers la nouvelle fiole en inscrivant cette note dans le tableur.
- Répétez les étapes 4.8 et 4.8.1 jusqu’à ce que toutes les mouches meurent.
- Pour chaque groupe de traitement, créez une courbe de survie comme indiqué dans Figure 1, afin d’afficher la probabilité de survie d’une mouche à un moment donné.
- Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches de traitement, en utilisant 100 mouches nouvellement fermées pour chaque expérience.
- Préparez un tableau dans lequel vous pourrez indiquer la durée de vie moyenne (jours de survie moyens de toutes les mouches pour chaque groupe), la moitié du temps de mort (période en jours nécessaire pour atteindre 50 % de mortalité) et la durée de vie maximale (nombre maximum de jours nécessaires pour atteindre 90 % de mortalité).
- Calculez les différences de pourcentage entre chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin.
- Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes de traitement.
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