$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ce protocole est un extrait de Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. Exigences préalables au traitement d’image
- Effectuer des préparations à livre ouvert de larves errantes du troisième stade (L3), comme décrit précédemment.
- Co-immunomarquage des terminaisons NMJ de la drosophile à l’aide d’une combinaison de deux marqueurs : Dlg-1 ou Hrp associé à Brp pour l’analyse avec « Drosophila NMJ Morphometrics », et Syt ou Csp associé à Brp associé à l’analyse « Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ».
REMARQUE : Les anticorps d’une même espèce peuvent être combinés en pré-marquant l’un d’entre eux avec un kit de conjugaison d’anticorps tel que les kits de marquage Zenon Alexa.
- Imagez les terminaux NMJ à l’aide du microscope de votre choix, par exemple, en fluorescence (avec ou sans ApoTome) ou en microscopie confocale.
- Acquérez une pile d’images à 2 canaux du terminal NMJ.
- Ajustez les paramètres du microscope de manière à ce que le canal 1 acquière le NMJ terminal immunomarqué avec Dlg-1 (ou Hrp, Syt, Csp) et le canal 2 le NMJ terminal immunomarqué avec Brp.
- En option, analysez des images à un canal (de synapses immunomarquées avec un seul anticorps) avec les macros. Image NMJs immunomarqués uniquement avec Dlg-1 ou Hrp pour l’analyse avec « Drosophila NMJ Morphometrics », ou Syt ou Csp pour « Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ».
REMARQUE : Il n’est pas possible d’analyser les synapses immunomarquées avec uniquement des anti-Brp.
- Exportez les images obtenues sous forme de fichiers .tiff individuels. Inversez l’ordre des canaux avant d’exécuter les macros si elles ne sont pas acquises comme indiqué.
2. Configuration logicielle requise et installation
- Téléchargez les macros : « Drosophila NMJ Morphometrics » et « Drosophila NMJ Bouton Morphometrics » sur le site suivant : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Déplacez le curseur dans le dossier « Mise à jour des macros 1 », et cliquez sur l’option « Affichage ». Une liste avec le contenu de ce dossier apparaîtra. Le dossier contient les macros « Drosophila NMJ Morphometrics » et « Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ».
REMARQUE : Les deux macros sont compatibles avec les versions 1.4 de Fidji, qui sont également fournies dans le même dossier. Les macros peuvent ne pas s’exécuter sur les versions récentes. Veuillez utiliser la version 1.4 fournie. Il n’est pas problématique de démarrer cette version, même sur les ordinateurs disposant d’une version Fidji plus récente.
- Cliquez sur « Télécharger tout ». Le contenu du dossier sera téléchargé sur l’ordinateur sous forme de fichier .zip. Décompressez le fichier téléchargé.
- Copiez les fichiers Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm et Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dans Fiji.app/plugins/ répertoire. Au redémarrage du programme, les macros apparaîtront en bas du menu déroulant Plugins.
3. Exécutez la sous-macro « Convertir en pile » pour créer des projections Z et des Hyperstacks des images NMJ
- Démarrez l’interface graphique en sélectionnant Plugins dans la barre d’outils et choisissez « Drosophila NMJ Morphometrics » dans le menu déroulant.
- Définissez le paramètre « Chaîne de fichier unique » dans l'interface graphique de la macro.
REMARQUE : Le logiciel du microscope utilise une signature d'identification pour organiser les plans et les canaux lors du stockage des piles sous forme de fichiers .tiff individuels. Le paramètre de chaîne de fichier unique saisi doit spécifier la signature attribuée par le logiciel au premier plan du premier canal (important : le plan le plus bas et le numéro de canal doivent être indiqués).
- Sélectionnez uniquement la sous-macro « Convertir en pile » et cliquez sur « ok » et sélectionnez le dossier où se trouvent les images. Si un répertoire principal avec plusieurs sous-dossiers est sélectionné, tous les fichiers '.tiff individuels du répertoire principal et du sous-dossier correspondant aux critères de chaîne de fichier unique seront traités.
- Si la pile z ne contient qu’un seul canal, cochez la case « Canal 1 uniquement ».
- Notez que deux nouveaux fichiers par image NMJ, appelés par défaut stack_image_name et flatstack_image_name apparaîtront. Ne stockez que ces piles et piles plates pour une analyse plus approfondie. La série de fichiers .tiff peut être supprimée à ce stade, ce qui réduit les capacités de stockage requises et évite les sources d’erreur potentielles.
4. Exécutez la sous-macro « Define ROI » pour délimiter le terminal NMJ qui vous intéresse
- Démarrez l’interface graphique de « Drosophila NMJ Morphometrics ».
- Cochez uniquement la case « Définir le ROI » et appuyez sur « OK » et sélectionnez le répertoire principal où sont stockées les images intitulées flatstack_name et appuyez sur « Sélectionner ». La sous-macro « Définir le retour sur investissement » recherche automatiquement dans tous les sous-dossiers du répertoire principal sélectionné.
- Lorsque la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil « Sélections à main levée » dans la barre d’outils.
- À l’aide de la souris, dessinez une sélection qui contient exclusivement le terminal NMJ complet qui vous intéresse et cliquez sur « OK » dans la fenêtre « Définir le terminal ». La macro passe à la projection suivante.
- Délimitez le prochain retour sur investissement et répétez l’opération jusqu’à ce que tous les retours sur investissement soient définis. Le fichier image ROI, nommé « roi_image_name », sera stocké dans le même répertoire que les images de pile et de projection précédemment générées pour chacune des images traitées. Le résultat de cette sous-macro est une image binaire du retour sur investissement en blanc sur fond noir.
5. Exécutez la sous-macro « Analyze » pour quantifier les fonctionnalités du terminal NMJ
- Allez dans la barre d’outils, sélectionnez « Plugins » et utilisez :
« Drosophile _NMJ_Morphometrics » lors de l’analyse de synapses immunomarquées avec l’anti-Dlg-1 ou l’anti-Hrp (canal 1) avec l’anti-Brp (canal 2), ou « Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics » lors de l’analyse des synapses immunomarquées avec l’anti-Syt ou l’anti-Csp (canal 1) avec le Brp (canal 2).
- Lorsque des piles d’images d’un canal doivent être analysées (le canal structurel Dlg-1 ou HRP pour « Drosophila_NMJ_Morphometrics », ou Syt ou Csp pour « Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics »), cochez la case « Canal 1 uniquement ».
- Ajustez l’échelle correspondant aux images à analyser.
- Si un pixel de l’image correspond à 2,5 μm, indiquez Échelle-Pixels = 1, Échelle-Distance en μm = 2,5. Si les deux paramètres sont laissés à 0, la zone NMJ, le périmètre, la longueur et la longueur de branche la plus longue seront exprimés en nombre de pixels.
- Si nécessaire, ajustez les paramètres d’analyse par défaut de la macro. N’effectuez des ajustements que si la sous-macro « Analyser » a déjà été exécutée avec des résultats insatisfaisants (voir la fin de cette section, et la section 6 pour les instructions sur la façon d’optimiser les paramètres).
- Cochez les cases « Analyser » et « Attendre » et appuyez sur « OK ».
- Cochez la case « Attendre » lors de l’exécution de la sous-macro « Analyser » sur des images à 2 canaux. Sinon, des erreurs dans le comptage des zones actives peuvent se produire en raison des capacités limitées de l’ordinateur.
- Lorsqu’une nouvelle fenêtre « Choisir un répertoire » s’ouvre, sélectionnez le répertoire où se trouvent les images et appuyez sur « sélectionner ». La macro analysera toutes les images stockées dans le répertoire principal et, le cas échéant, les dossiers suivants (en utilisant les trois fichiers de l’exécution des sous-macros précédentes : stack_image_name, flatstack_image_name et roi_image_name). La macro traite chaque image individuellement et consécutivement. Cela peut prendre plusieurs minutes par pile d’images (en fonction de la capacité de l’ordinateur).
- Après avoir exécuté la macro, notez qu’un nouveau fichier image nommé res_image_name pour chaque synapse analysée stockée sera créé dans le dossier parental. Les mesures quantitatives seront stockées dans un fichier « results.txt ».
- Inspectez toutes les images de résultat pour détecter et exclure les images présentant des erreurs de segmentation. Les erreurs de segmentation possibles sont décrites dans le Tableau 1, ainsi que des conseils sur la façon d’ajuster les paramètres pour contourner ces erreurs. Les images de résultat avec de telles erreurs de segmentation sont fournies à titre d’exemples dans Figure 1.
REMARQUE : Lors de l’exécution de la macro avec les paramètres par défaut observés dans l’interface utilisateur, la précision était d’environ 95 % lorsque l’évaluation de la macro était comparée à l’évaluation manuelle.
6. Ajuster les paramètres de macro aux images
- Lorsque plus de 5 % des images présentent des erreurs de segmentation, explorez les différents algorithmes pour définir/choisir les paramètres macro les plus adaptés aux images.
- Ajuster la valeur du rayon de roulement de la bille
REMARQUE : La fonction de rayon de la balle roulante soustrait l’arrière-plan de l’image. Cette fonction est d’une importance cruciale lorsque vous travaillez avec des images acquises sur des microscopes à fluorescence et/ou lorsque les images ont un bruit de fond élevé. La soustraction de l'arrière-plan aidera les étapes de seuillage automatique de la macro à produire une segmentation adéquate des terminaux NMJ.
- Sélectionnez trois images NMJ stack_image_name générées par la sous-macro « Convertir en pile ». Choisissez des images représentatives du jeu de données d’images.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez Image | Couleur | Canaux partagés. Deux piles d’images seront créées, l’une représentant respectivement le canal 1 et l’autre le canal 2, et les enregistreront.
- Ouvrez la pile d’images appartenant au canal 1 open, correspondant à l’immunomarquage Dlg-1, Hrp, Syt ou Csp.
- Exécutez le filtre « Soustraire l’arrière-plan » en sélectionnant « Traiter » dans la barre d’outils, puis « Soustraire l’arrière-plan... » dans le menu déroulant.
- Cliquez sur la case à cocher de l’aperçu dans la fenêtre contextuelle et ajustez le rayon de la balle roulante à la valeur la plus appropriée pour les images. Le paramètre « Rayon de la balle roulante » doit être ajusté aux valeurs qui augmentent le contraste entre la synapse et l'arrière-plan (voir Figure 2A').
- Voir Figure 2 pour un exemple. Dans le panneau A, certaines parties de la synapse présentent les mêmes niveaux de gris que l'arrière-plan, tandis que dans Figure 2 panneau A', un « rayon de balle roulante » de 500 entraîne un fort contraste entre la synapse et l'arrière-plan.
- Créez une projection z en sélectionnant dans la barre d’outils Image | Empiler| Z-projection, choisissez Type de projection = Intensité maximale et enregistrez l’image résultante. Lorsque la valeur appropriée pour le rayon de la balle roulante est définie, exécutez l’algorithme « Soustraire l’arrière-plan » sur les images représentatives restantes avec la même valeur de rayon de balle roulante. Créez les projections Z et enregistrez-les (dans n’importe quel répertoire).
REMARQUE : La valeur du rayon de la balle roulante pour les images 8 bits ou RVB doit être au moins aussi grande que le rayon du plus grand objet de l’image qui ne fait pas partie de l’arrière-plan. Pour les images 16 bits et 32 bits, le rayon doit être inversement proportionnel à la plage de valeurs des pixels.
- Déterminer les différents seuils automatiques qui seront utilisés
- Ouvrez les projections Z enregistrées à l’étape précédente (6.2.6) et sélectionnez Image | Ajuster | Seuil automatique | Essayez tout.
- Comme une image de résultat de seuil binaire apparaîtra avec tous les différents algorithmes de seuil automatique, déterminez l’algorithme le plus approprié pour les images.
- Lorsque vous exécutez la macro ultérieurement, modifiez le seuil dans les paramètres de la macro en conséquence.
- Utilisez des seuils plus restrictifs tels que « RenyiEntrophy » ou « Moments » comme seuil de contour NMJ et des seuils plus permissifs tels que « Li » pour déterminer le squelette NMJ et « Huang » pour déterminer les zones actives. Lorsque les images sont très nettes avec peu ou pas d’arrière-plan, utilisez « Huang » comme « seuil de contour NMJ ». Sinon, des parties de la synapse peuvent être manquantes après la segmentation de l’image.
- Voir Figure 2B pour un exemple. Une segmentation appropriée de la synapse est obtenue avec des seuils automatiques mis en évidence par des cases vertes. Certains exemples de seuils non adaptés sont mis en évidence par des cases rouges (cochez les synapses à fort grossissement). Dans ce dernier, soit des parties de la synapse sont manquantes, soit des parties de l’arrière-plan sont incluses.
- Déterminer la taille maximale des petites particules
REMARQUE : Cette fonction exclura de l’analyse toutes les particules détectées par le seuil de contour NMJ et le seuil de squelette qui sont inférieures à la valeur définie dans le « paramètre des petites particules ». Cette valeur est définie en pixels. Cette fonction sert de filtre de bruit et est très utile lorsque des taux élevés de bruit de fond non uniforme (tels que des cristaux/poussières) sont présents dans les images obtenues.
- Ouvrez les projections Z enregistrées à l’étape 6.2.6 et réglez l’échelle pour détecter le nombre de pixels via Analyser | Réglez l’échelle. Appliquez les paramètres suivants : distance en pixels = 1, distance connue = 1, rapport hauteur/largeur des pixels = 1, unité de longueur = pixel et appuyez sur « Ok ». Cliquez sur l’outil « Sélection ovale » dans la barre d’outils.
- À l’aide de la souris, dessinez une sélection autour des particules uniques présentes dans l’immunomarquage mais n’appartenant pas au NMJ. Appuyez sur Ctrl+m pour un utilisateur Windows ou cmd+m pour les utilisateurs Mac. Une fenêtre de résultat s’ouvrira, indiquant la zone des particules sélectionnées en nombre de pixels.
- Répétez l’étape précédente plusieurs fois avec plusieurs artefacts présents dans les images pour déterminer la plus grande zone de particule/artefact contaminante. Il s’agit de la valeur à définir dans le paramètre lors de l’exécution ultérieure de la macro. Lors de l’exécution de la macro, définissez la « Taille des petites particules » comme la plus petite taille de particule observée : du pus, une marge de 25 %.
- Voir Figure 2D pour un exemple. Le plus grand cristal détecté a une zone de 112 pixels. Le paramètre « Taille des petites particules », lors du traitement de cette image avec la macro, doit être réglé sur 125 - 150.
- Déterminer la taille minimale du bouton
REMARQUE : Cette fonction exclura de l’analyse tous les boutons détectés par le seuil de contour NMJ qui sont inférieurs à la valeur définie. Cette valeur est définie en pixels.
- Suivez les mêmes étapes que celles décrites à la section 6.4, mais dans ce cas, dessinez une sélection autour des plus petits boutons présents dans le terminal NMJ. Choisissez la plus petite zone correspondant au plus petit bouton parmi ceux mesurés. Il s’agit de la valeur à définir dans le paramètre de taille minimale du bouton lors de l’exécution ultérieure de la macro.
- Définir la valeur « Tolérance maximale au bruit »
- Pour définir la valeur « Trouver la tolérance maximale au bruit » pour la macro, ouvrez la pile Z du canal 2 enregistrée dans la section 6.2.2.
- Allez dans l’onglet des plugins dans le menu contextuel, sélectionnez Processus | Maximum(3D), et lorsque le maximum_image_name apparaît (ce qui peut prendre quelques minutes), fermez la pile d’images d’origine.
- Sélectionnez le Maximum..._image_name (la pile d’images nouvellement obtenue) et sélectionnez Plugins | Processus | Minimum (3D), lorsque la nouvelle image Minimum de Maximum..._image_name apparaît pour fermer la pile Maximum... _image_name.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez Traiter | Trouvez des maxima.... Une nouvelle fenêtre « Trouver des maxima... » s’ouvrira. Cochez la case « Prévisualiser la sélection du point... » et remplissez la case « Tolérance au bruit » avec le paramètre de macro par défaut 50. Les points maximaux seront indiqués dans l’image sous forme de petites croix.
- Augmentez la valeur « Tolérance au bruit » si vous observez un excès de zones actives annotées, c’est-à-dire des croix qui ne sont pas au-dessus des zones actives qui ne sont pas nettes sur le plan de pile sélectionné, ou des fausses zones actives qui sont détectées en arrière-plan.
- D’autre part, si vous observez des zones actives incomplètement annotées, c’est-à-dire que les zones actives au foyer ne sont pas reconnues, diminuez la valeur « Tolérance maximale au bruit ». Continuez à essayer différentes valeurs en suivant cette procédure jusqu’à ce que les croix étiquettent correctement les zones actives au point. Remplissez le « Trouver la tolérance maximale au bruit » avec cette valeur.
- Voir Figure 2C pour un exemple. Trop de zones actives sont détectées. Dans Figure 2C', seules les zones actives sont détectées lors de l'augmentation de la valeur « Tolérance maximale au bruit ».
- Exécutez la sous-macro « Analyser » pour les images représentatives sélectionnées à l’étape 5.1, avec les paramètres définis dans toutes les étapes précédentes.
- Ajuster les seuils inférieur et supérieur de Brp-puncta
- Notez qu’un nouveau fichier apparaîtra après l’exécution de la macro conformément à l’étape 6.6, appelée 2_active_zone_stack_image_name. Dans cette pile d’images, les zones actives détectées par la fonction « Trouver les maxima » sont indiquées par des points blancs dans chaque plan.
- Ouvrez ce fichier en le faisant glisser et en le déposant dans la barre d’outils et sélectionnez Image | Pile | Projet Z | Type de projection = Somme des tranches. Une projection de la 2_active_zone_stack_image_name sera obtenue.
- Sélectionnez une image | Ajuster | Seuil. Une nouvelle fenêtre « Seuil » s’ouvrira. Faites glisser la barre supérieure pour choisir une valeur seuil où tous les foyers/points positifs à Brp souhaités sont visualisés en rouge.
REMARQUE : Si le seuil est fixé trop bas, un excès de zones actives sera comptabilisé. S’il est réglé trop haut, une fraction des zones actives sera manquée.
- Voir Figure 2E pour un exemple. Lorsque le seuil est défini sur 400, la plupart des zones actives (symbolisées par des foyers de 1 pixel) ne sont pas incluses dans la segmentation, car elles ne sont pas mises en évidence en rouge (Figure 2E). Lorsque le seuil est défini sur une valeur de 50, toutes les zones actives sont mises en surbrillance en rouge (Figure 2E').
- Définissez cette valeur comme seuil minimum. Laissez « Seuil de ponctuation supérieur » sur la valeur maximale.
- Relancez la sous-macro « Analyser » pour les images représentatives avec les paramètres définis dans toutes les étapes précédentes de cette section. Évaluez de manière critique les fichiers d’image résultants et assurez-vous que la segmentation est effectuée correctement. Si ce n’est pas le cas, réajustez les paramètres en fonction de la nature des erreurs de segmentation (Figure 1, Tableau 1).
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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