Ce protocole est un extrait de Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).
1. Lésion à deux photons et imagerie confocale
- Configuration du microscope
REMARQUE : Un microscope confocal à balayage laser avec un laser à deux photons a été utilisé pour cette expérience, mais d’autres systèmes avec une configuration équivalente suffiront également. Le laser à deux photons (930 nm) a été utilisé pour l’administration des lésions et un laser à l’argon (488 nm) a été utilisé pour l’imagerie confocale de la GFP.
- Au début de chaque séance, allumez le laser à deux photons et/ou le(s) laser(s) confocal(s), ainsi que le microscope. Ouvrez le logiciel d’imagerie.
- Pour les lésions à deux photons, configurez les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser à deux photons à 930 nm (1 950 mW).
- Sélectionnez le mode de balayage linéaire. Ouvrez complètement le sténopé. Augmentez l’intensité du laser à ~20 % (390 mW).
- Sélectionnez 512 x 512 comme balayage de l’image. Utilisez la vitesse de balayage maximale (généralement avec un temps de séjour des pixels de 0,77 μs). Assurez-vous que le nombre moyen est de 1 et que la profondeur de bits est de 8 bits.
- Réglez le gain sur ~750 et le décalage sur 0.
- Enregistrez ce protocole expérimental prédéfini en tant qu’ablation 2P GFP 930, ce qui permet une réutilisation facile dans de futures expériences.
- Pour l’imagerie confocale, configurez les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser Argon à 488 nm :
- Sélectionnez l’onglet Acquisition, puis Z-stack.
- Sous « Laser », allumez l’alimentation du laser Argon 488 nm.
- Allez dans Canaux, sélectionnez le laser de 488 mm et augmentez la puissance du laser à 5-10 %. Pour le sténopé, utilisez l’unité d’aération 1-2 (AU). Réglez le gain à 650.
- En mode d’acquisition, sélectionnez 1024 x 1024 comme balayage de trame, utilisez la vitesse de balayage maximale, un nombre moyen de 2 et une profondeur de bits de 8 bits.
- Enregistrez ce protocole expérimental prédéfini en tant qu’imagerie GFP.
- Anesthésie des larves avec éther diéthylique et montage
- Dans une hotte, placez un plat en verre de 60 mm dans une boîte de Pétri en plastique de 15 cm. Pliez et posez un morceau de papier de soie au fond du plat en verre, puis placez une plaque de gélose au jus de raisin sur le tissu. Ajoutez de l’éther diéthylique dans le plat en verre, jusqu’à ce que le papier de soie soit trempé et qu’il reste une couche d’éther liquide dans le plat. Gardez le couvercle en tout temps.
- Préparez une lame de verre avec une goutte d’huile d’halocarbure 27 au centre. Ajoutez 4 points de graisse sous vide sur les quatre coins de la glissière, pour soutenir plus tard la lamelle.
- À l’aide d’une pince, prélevez une larve nettoyée et placez-la sur la plaque de gélose dans le plat en verre de 60 mm. Couvrez le plat en verre avec son couvercle et attendez que la larve cesse de bouger. Pour les blessures/imagerie SNP, retirez la larve dès que sa queue cesse de se contracter. Pour le SNC, attendez que toute la larve devienne immobile, en particulier les segments de tête.
REMARQUE : Le moment de l’exposition à l’éther est critique. Voir Discussion.
- Ramassez soigneusement la larve anesthésiée et placez-la la tête vers le haut dans la goutte d’huile d’halocarbure sur la lame. Ajoutez une lamelle sur le dessus de la diapositive. Appliquez une légère pression sur la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche la larve (Figure 1A).
- Ajustez la position de la larve en poussant doucement la lamelle vers la gauche ou la droite pour faire rouler la larve, de sorte que le neurone/axone/dendrite d'intérêt soit en haut et le plus proche de la lentille du microscope.
- En cas de blessure au SNP, montez la larve côté dorsal vers le haut, de sorte que les deux trachées soient visibles. Ensuite, roulez la larve de ~30 degrés vers la gauche pour endommager les axones de neurones de classe III da (Figure 1B et 1C), 90 degrés pour endommager les axones de neurones de classe IV (Figure 1B et 1E), ou ~30 degrés pour endommager les dendrites de neurones de classe IV da (Figure 2A).
- En cas de lésion du SNC, positionner la larve de manière à ce qu’elle soit parfaitement ventrale vers le haut (Figure 3A), de sorte que la région d’intérêt soit la plus proche de la lentille du microscope dans le plan z.
- Lésions par laser à deux photons
- Placez la lame avec la larve sous le microscope et fixez-la en place avec le support de lame sur la platine. Utilisez l’objectif 10X (0,3 NA) pour trouver la larve.
- Ajoutez 1 goutte d’huile d’objectif sur la lamelle, passez à l’objectif 40X (1,3 NA) et ajustez la mise au point.
- Passez en mode balayage et réutilisez le protocole expérimental 2P GFP 930 Ablation. Assurez-vous que le sténopé est complètement ouvert.
REMARQUE : La configuration doit être optimisée en fonction de chaque système.
- Démarrez le mode Live pour localiser la région d’intérêt (ROI) et affinez les paramètres pour obtenir une bonne qualité d’image avec le zoom approprié.
REMARQUE : Le but de cette étape est de trouver le neurone/l’axone/la dendrite à blesser, plutôt que de prendre l’image de la meilleure qualité. Par conséquent, utilisez les paramètres minimaux suffisants pour visualiser la zone cible, afin d’éviter la surexposition ou le photoblanchiment.
- Arrêtez l’analyse en direct, afin que le bouton Recadrer devienne disponible. Laissez l’image fixe servir de feuille de route. Sélectionnez la fonction Recadrage et ajustez la fenêtre de balayage pour vous concentrer sur la cible à blesser.
- Réduire le retour sur investissement à la taille du site potentiel de la blessure. Par exemple, il suffit de couvrir la largeur d’un axone ou d’une dendrite, pour assurer la précision de la blessure et réduire les dommages aux tissus voisins. Si vous le souhaitez, zoomez sur le retour d’investissement avant de recadrer, ce qui permet d’obtenir des dommages plus précis.
- Ouvrez une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduisez la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Déterminez l’augmentation de l’intensité du laser en fonction du signal de fluorescence tissulaire balayé en mode Live.
- En règle générale, réglez l’intensité du laser à deux photons à partir de 25 % pour les lésions PNS et de 50 à 100 % pour les lésions VNC. Pour les lésions axonales PNS, assurez-vous que l’intensité laser est de ~480 mW et que le temps de séjour des pixels est de 8,19 μs. Pour la lésion de l’axone VNC, assurez-vous que l’intensité du laser et le temps de séjour des pixels sont généralement de 965-1930 mW et de 8,19-32,77 μs, respectivement.
- Lancez l’analyse continue. Laissez le curseur de la souris sur le bouton Continu. Gardez un œil attentif sur l’image et arrêtez le balayage dès qu’une augmentation drastique de la fluorescence est observée.
REMARQUE : L’apparition du pic de fluorescence est due à l’auto-fluorescence au site de la blessure.
- Revenez au mode Live en réutilisant les paramètres. Trouvez la région d’intérêt qui vient d’être ciblée en ajustant le focus.
REMARQUE : Une bonne indication d’une blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés sur le site de la blessure.
- Passez au neurone suivant et répétez à partir de l’étape 1.3.5, pour blesser plusieurs neurones chez un seul animal. Ou répétez l’étape 1.3.5 tout en augmentant progressivement la puissance et/ou en réduisant la vitesse de balayage si la blessure initiale était insuffisante.
REMARQUE : Dans le cas où la puissance laser est trop élevée, une grande zone endommagée sera visible dans l’image de balayage en direct après la blessure. Trop de blessures peuvent entraîner la mort de la larve.
- Récupérez la larve en retirant soigneusement la lamelle et en transférant la larve blessée sur une nouvelle plaque avec de la pâte de levure. Creusez plusieurs grottes sur la plaque de gélose avec des pinces ; Alternativement, faites un îlot d’agar dans la plaque au lieu d’utiliser toute la plaque, afin de réduire la possibilité que la larve rampe hors de la plaque.
- Placez la plaque dans une boîte de Pétri de 60 mm avec un tissu humide (imbibé d’une solution d’acide propionique à 0,5 %) et cultivez à température ambiante ou à 25 °C
REMARQUE : La larve restera au stade larvaire pendant environ une journée supplémentaire à température ambiante (22 °C) par rapport à 25 °C.
- Imagerie confocale post-blessure
- Imagez la larve blessée aux points temporels souhaités en préparant la larve en utilisant la même procédure d’anesthésie et de montage qu’à l’étape 1.2, puis en imageant avec le laser confocal.
REMARQUE : Imagez la larve 24 h après la blessure (IA) pour confirmer la lésion axonale et à 48 h AI (neurones da de classe IV) ou 72 h AI (neurones da de classe III) pour évaluer la régénération.
- Localisez la larve à l’aide de l’objectif 10X, puis passez à un objectif 25X (0,8 NA). Réutilisez le protocole expérimental GFP Imaging.
- Cliquez sur le bouton En direct et trouvez le même neurone blessé précédemment.
- Définissez la première et la dernière position Z dans la fenêtre de balayage en direct. Appuyez sur stop et cliquez sur Démarrer l’expérience pour acquérir une image Z-stack.
REMARQUE : Assurez-vous qu’un point de normalisation (le point convergent de l’axone) est inclus lors de la capture d’images afin que la quantification de la régénération soit possible (Figure 1D, 1F) - cela est discuté plus en détail dans la section analyse des données.
- Passez au traitement d’image, sélectionnez l’image qui vient d’être prise et générez une projection d’intensité maximale. Enregistrez à la fois les images de la pile z et de la projection d’intensité maximale.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Veuillez cliquer ici...