$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ce protocole est extrait de Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Conception de Mo pour l’imagerie de cellules vivantes
- Pliez la séquence d'ARN cible pour prédire la structure secondaire de la cible d'ARNm à l'aide de la « forme ARN » du serveur mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Collez/téléchargez la séquence cible au format FATA, sélectionnez une sous-optimalité de 5 ou 10 % (structures avec une énergie libre de pliage à 5 ou 10 % de la valeur MFE, respectivement), et ajustez le nombre maximum de plis calculés en conséquence (par exemple, plus grand pour une sous-optimalité de 10 %).
REMARQUE : L’inclusion de structures secondaires sous-optimales lors de la conception des MB permet d’identifier des régions au sein de l’ARNm cible qui peuvent être plus flexibles ou plus rigides que ce qui est prévu pour la structure d’énergie libre minimale (MFE) seule, ce qui améliore la conception globale des MB adaptés à l’imagerie de cellules vivantes.
- Sélectionnez un « travail immédiat » pour les cibles d’ARNm de 800 nucléotides (nt), ou un « travail par lots » pour les longueurs d’ARNm comprises entre 801 et 8 000 nt. Enregistrez le fichier « ss-count » en tant que fichier texte simple.
- Utilisez le fichier « ss-count » obtenu à l’étape 1.1 comme entrée pour le programme PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) avec les paramètres souhaités, pour concevoir plusieurs Mo pour la cible d’ARNm (voir les tutoriels décrivant l’utilisation du programme PinMol à https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Déterminer la spécificité des MB sélectionnés en effectuant une analyse BLAST : utiliser « blastn » avec la base de données appropriée (par exemple, pour les MB spécifiques de l’ARNm d’oskar, utilisez la base de données « refseq-rna » et l’organisme Drosophila melanogaster).
- Identifier toute expression tissulaire spécifique de la cible de l’ARNm (par exemple pour l’ARNm oskar, Flybase> les données d’expression à haut débit> la puce d’anatomie FlyAtlas ou modENCODE Anatomy RNA-Seq ; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) et comparer avec n’importe quel résultat positif de BLAST. Éliminez les sondes qui présentent une homologie croisée de >50 % avec d’autres ARNm qui sont également exprimés dans le tissu/la cellule d’intérêt.
- Sélectionnez la paire fluorophore et quencher appropriée à la configuration de microscopie disponible pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes (par exemple Cy5/BHQ2).
2. Synthèse, purification et caractérisation des MB
- Utiliser la synthèse et la purification en interne comme décrit précédemment dans Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), ou les services de fournisseurs commerciaux, pour synthétiser et purifier un à cinq MB (voir la note ci-dessus), en utilisant le schéma d'étiquetage suivant : [5'(Fluorophore)-(Liaison C3 ou C6)-(Séquence 2'-O-méthyl MB)-(Quencher)3']. Purifier les MB à l’aide de l’HPLC en phase inverse, en interne ou en utilisant les services du fournisseur commercial.
REMARQUE : Les phosphoramidites utilisées pour la synthèse automatisée des sondes doivent avoir la modification 2'-O-méthyl ribonucléotide. On peut également utiliser des chimères d'alternance d'acides nucléiques verrouillés (LNA) et de modifications 2'-O-méthyl pour augmenter la stabilité d'un hybride entre un MB plus court et son ARNm cible.
- Synthétiser des oligonucléotides d’ADN qui correspondent à la séquence de la région d’ARN ciblée et qui sont donc complémentaires à la région sonde des MB, pour une utilisation dans la caractérisation in vitro (voir les étapes 2.3 à 2.5 ; note ci-dessus). Maximiser l’hybridation du MB avec le mimétisme de la cible de l’ADN-oligonucléotides, en incluant à chaque extrémité de la cible de l’ADN quatre nucléotides supplémentaires, tels que trouvés dans la séquence de l’ARNm cible.
REMARQUE : Une caractérisation plus rigoureuse de l'efficacité du MB à détecter la séquence ciblée peut être effectuée à l'aide de cibles d'ARN synthétisées in vitro au lieu d'oligonucléotides d'ADN complémentaires.
- Effectuez la dénaturation thermique du MB seul, mesurez sa température de fusion (Tm) et confirmez que le MB prend la forme d’épingle à cheveux souhaitée à température physiologique. Nous avons observé des valeurs Tm comprises entre 60 et 90 °C.
- Effectuer la dénaturation thermique du MB en présence de la cible oligonucléotidique de l'ADN et mesurer la Tm de l'hybride cible MB :ADN, comme décrit précédemment dans Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Une Tm comprise entre 55 et 60 °C est souhaitée pour l’hybride MB :ADN.
- Effectuer des réactions d’hybridation in vitro avec la cible d’oligonucléotides d’ADN correspondante, et déterminer l’efficacité de la formation d’hybrides MB :ADN à température physiologique, comme décrit précédemment dans Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Une cinétique d’hybridation rapide avec l’imitation de la cible d’ADN est souhaitée, mais les MB qui ne présentent pas une efficacité d’hybridation élevée avec des cibles d’ADN peuvent avoir une meilleure performance avec l’ARNm cible in vitro et/ou in vivo.
3. Dissection et préparation de chambres d’œufs individuelles pour la micro-injection
- Nourrissez les femelles nouvellement écloses et accouplées pendant 2-3 jours avec de la pâte de levure fraîche.
- Anesthésiez les mouches sur un tampon de CO2 et, à l’aide d’une pince à épiler fine (Dumont #5), transférez 1 à 2 femelles dans une goutte d’huile d’halocarbure 700 sur une lamelle en verre.
- À l’aide d’une pince à épiler, orientez la mouche avec le côté dorsal vers le haut sous un stéréomicroscope. Disséquez l’abdomen féminin en faisant une petite incision à l’extrémité postérieure et pressez doucement la paire d’ovaires dans l’huile.
- Explantez les ovaires sur une goutte d’huile sur une nouvelle lamelle. Tenez doucement un ovaire avec une pince à épiler tout en pinçant les plus jeunes stades de l’ovariole avec l’autre pince à épiler. L’ARNm de l’oskar est activement localisé au milieu de l’ovogenèse et après celle-ci (stades > 7), et les chambres d’ovules plus jeunes (stades < 7) sont plus difficiles à injecter et ne survivent pas aussi longtemps. Tirez lentement sur la lamelle (avec un mouvement vers le bas) jusqu’à ce que les ovaires ou les chambres d’œufs soient isolés et alignés verticalement. Séparez davantage les chambres d’œufs uniques en déplaçant les étapes indésirables de la chaîne d’œufs ovarioles.
REMARQUE : Assurez-vous que les chambres à œufs taquinées individuellement ne flottent pas dans l’huile et qu’elles adhèrent à la lamelle. Ceci est important pour la réussite de la micro-injection et de l’acquisition d’images.
4. Micro-injection de MBs dans les cellules nourricières des chambres d’oeufs
- Préparez la solution de MB à l’aide d’une balise moléculaire (par exemple osk2216Cy5), ou d’un mélange de deux MB qui ciblent différents ARNm et qui sont marqués avec des fluorophores spectralement distincts (par exemple osk2216Cy5 et drongo1111Cy3). Utiliser une concentration de 200 à 300 ng/μL chaque MB dans HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 et 100 mM NaCl). Pour un cocktail de quatre MB marqués avec le même fluorophore qui ciblent le même ARNm à 200 ng/μL chacun dans HybBuffer (par exemple osk82, osk1236, osk2216). Faites tourner la solution de MB immédiatement avant de charger l’aiguille pour la micro-injection.
- Sélectionnez l’objectif. Un objectif d’huile 40x est recommandé pour trouver une chambre d’œuf appropriée et pour effectuer une micro-injection.
- Montez la lamelle avec la chambre d’œuf disséquée sur la platine du microscope. Placez l’objectif en position focale et identifiez une chambre d’ovule à un stade de développement moyen à avancé, correctement orientée pour la micro-injection (c’est-à-dire avec l’axe AàP perpendiculaire à l’extrémité de l’aiguille pour permettre une injection facile dans une cellule nourricière proximale à l’ovocyte).
- Chargez une aiguille (commerciale ou préparée sur place) avec une solution de ~1 μL MB (voir étape 1.1) et connectez-la au micro-injecteur. Pour les micro-injections dans les chambres d’œufs de D. melanogaster, orientez l’aiguille (voir tableau des matériaux) à un angle de <45° par rapport à la platine du microscope (par exemple 30°) pour éviter de perforer plusieurs cellules nourricières.
- Réglez l’injecteur avec une pression d’injection de 500 à 1 000 hPa et une pression de compensation de 100 à 250 hPa (voir tableau des matériaux).
- Déplacez lentement la platine pour amener dans le champ de vision une zone de la goutte d’huile vide des chambres à œufs.
- À l’aide du joystick du micromanipulateur, abaissez doucement l’aiguille dans la goutte d’huile et faites la mise au point sur sa pointe vers la périphérie du champ de vision.
- Effectuez une fonction de « nettoyage » pour éliminer l'air de la pointe de l'aiguille et pour vous assurer qu'il y a un écoulement de l'aiguille.
- Amenez l’aiguille à la position d’origine et concentrez-vous sur la chambre d’œuf à micro-injecter, puis ramenez l’aiguille à l’affût et positionnez-la près du bord de la chambre d’œuf.
- Effectuez un réglage fin de la position Z de l'objectif de sorte que la membrane séparant les cellules folliculaires des cellules nourricières soit nette.
- Insérez l’aiguille dans une cellule infirmière et effectuez l’injection pendant 2 à 5 secondes.
- Retirez délicatement l’aiguille et rétractez-la en position d’origine.
- Réglez l’objectif sur le grossissement souhaité pour l’acquisition de l’image (60-63x ou 100x), faites la mise au point sur la chambre à œufs et commencez l’acquisition.