Ce protocole est un extrait de Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).
1. Génétique et dépistage des mouches (Figure 1 et Figure 2)
- Lorsque les embryons injectés se développent en adultes, croisez chaque mouche G0 avec des mouches équilibreuses. Sélectionnez un équilibreur approprié pour le chromosome contenant l’allèle ciblé.
- Anesthésez la progéniture F1 de chaque croisement G0 sur un tampon CO2 et choisissez au hasard 10 à 20 mâles sous un stéréomicroscope. Croisez-les individuellement pour les femelles équilibreuses comme le montre Figure 2.
- Lorsque les larves F2 éclosent, choisissez le seul père F1 de chaque croisement et extrayez l’ADNg à l’aide du protocole de préparation de l’ADN génomique d’une mouche :
- Préparez le tampon d’extraction de l’ADNg : 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, conserver à température ambiante. Préparez une solution mère de protéinase K à 20 mg/mL et conservez-la au congélateur.
- Placez chaque mouche dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 mL et étiquetez le tube. Conserver au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
- Préparez un nouveau volume de travail de tampon d’extraction d’ADNg contenant une concentration finale de 200 μg/mL de protéinase K.
Remarque : N’utilisez pas d’ancienne mémoire tampon pour cette étape.
- Écrasez chaque mouche pendant 10 à 15 s avec une pointe de pipette contenant 50 μL de tampon d’écrasement sans distribuer le liquide. Répartissez le tampon restant dans le tube et mélangez bien. Incuber à 37 °C pendant 20 à 30 min.
- Mettez les tubes dans un bloc chauffant à 95 °C pendant 1 à 2 minutes pour inactiver la protéinase K.
- Essorez pendant 5 min à 10 000 x g. Conservez la préparation à 4 °C pour une analyse PCR plus approfondie.
- Utilisez la même méthode pour préparer l’ADNg d’une mouche nos-Cas9, qui sert de contrôle négatif. Effectuez des tests PCR en trois étapes pour identifier le HDR correct (Figure 1, Figure 3) en utilisant l’ADNg de chaque mâle F1 comme modèle5. Utilisez 1 μL de la préparation de l’ADN dans le système de réaction PCR suivant : 10 μL de 2x PCR Master Mix avec colorant, 1 μL de chaque amorce (10 μM), 1 μL de matrice d’ADN et 7 μL de ddH2O.
- Comme le montre Figure 3A, effectuer une PCR à l'aide des amorces fwd1 et rev1 pour détecter l'existence de l'insertion ou du remplacement ; effectuer une PCR à l'aide des amorces fwd2 et rev2 pour vérifier l'insertion ou le remplacement à partir de la région 3' ; effectuer une PCR à l'aide des amorces M13F et rev3 pour vérifier les extrémités HDR (Tableau 1C).
- Conservez les lignes de mouche avec le HDR d’extrémité confirmé et établissez des crosses équilibrées à partir de la génération F2. Le croisement vers les mouches équilibreuses est à nouveau pour éliminer toute mutation involontaire sur d’autres chromosomes.
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