$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ce protocole est un extrait de Koon et al., Preparation of Procaryotic and Eucaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.(2019).
1. Préparation et fixation
- Préparez Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
- Anesthésie les mouches adultes en utilisant 100 % de dioxyde de carbone. Placez les adultes anesthésiés (environ 10 à 30 mouches) dans un petit flacon en plastique à bouchon à vis ou un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- Immerger les mouches anesthésiées dans 1 mL de fixateur (1,25 % de glutaraldéhyde, tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2) pendant 2 h (ou toute la nuit) à 4 °C. Si les mouches flottent à la surface du fixateur, ajoutez quelques gouttes de polyéthylène glycol tert-octylphényléther à 2,5 % pour affaiblir la tension superficielle du fixateur permettant une immersion totale du tissu. Retirez le fixateur à l’aide d’une pipette en verre.
2. Lavage et déshydratation
- Laver et déshydrater Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
- Lavez l’échantillon fixé trois fois avec 1 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7,2 à température ambiante pendant 10 min dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Retirez chaque lavage à l’aide d’une pipette en verre, en faisant attention de ne pas enlever les mouches.
- Déshydrater l’échantillon à l’aide d’une série d’éthanol gradué, pendant 10 min dans un volume de 1 mL dans un tube à microfuge. Les concentrations d’éthanol sont les suivantes : 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Retirez l’éthanol à l’aide d’une pipette en verre, en faisant attention de ne pas enlever les mouches.
- Conservez l’échantillon dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec juste assez d’éthanol à 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.
3. Séchage
- Effectuer un séchage chimique à l’aide d’hexaméthyldisilazane (HMDS).
- Remplacez la solution à 100 % d’éthanol par une solution 1:2 de HMDS et d’éthanol à 100 % pendant 20 min. Remplacez la solution 1:2 par une solution 2:1 de HMDS et d’éthanol à 100 % pendant 20 min. Remplacez la solution 2:1 par du HMDS à 100 % pendant 20 min. Répétez une fois.
Remarque : Le HMDS est inflammable et constitue une toxine aiguë (voie cutanée). Les HMDS doivent être manipulés dans une hotte chimique à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection.
- Transvasez l’échantillon dans un HMDS, s’il s’agit d’un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, dans une parabole de pesée en aluminium jetable. Une fois dans le plat de pesée en aluminium, remplacez le 100 % HMDS par juste assez de 100 % HMDS frais pour couvrir l’échantillon.
- Transférez l’échantillon dans un dessiccateur sans vide en plastique ou en verre avec un dessiccateur frais (5-6 cm de profondeur) et placez-le dans une hotte chimique. Vous pouvez également placer l’échantillon directement dans une hotte chimique pour le faire sécher à l’aide d’un couvercle amovible, tel qu’une boîte, afin d’éviter que des débris ne tombent sur l’échantillon. Laisser sécher l’échantillon pendant 12 à 24 h.
4. Montage
- Mont Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
- Étiquetez le bas de l’embout de montage en aluminium pour indiquer ce qui est placé sur le dessus.
Placez les mouches séchées dans la position souhaitée sur une languette adhésive ou adhésive en carbone fixée au sommet d’un talon sous un microscope à dissection à l’aide d’une pince à épiler de précision.
- Appliquez un adhésif conducteur d’argent, c’est-à-dire de la peinture argentée, sur les bords extérieurs des talons. Connectez la peinture argentée aux mouches à l’aide d’un cure-dent pour assurer la conductivité. Ne laissez pas la peinture toucher la zone d’imagerie souhaitée.
- Placez les talons dans une boîte porte-talon et placez la boîte porte-talon ouverte dans un dessiccateur. Laissez la peinture argentée sécher au moins 3 h ou toute la nuit pour de meilleurs résultats.