Ce protocole est un extrait de Sunderhaus et Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fixation de la tête sur les colliers et enrobage dans la paraffine
REMARQUE : Toutes les étapes du processus de fixation doivent être effectuées dans une hotte. Le benzoate de méthyle, bien qu’il ne présente pas de risque pour la santé, a une odeur très distincte, qui peut être écrasante si elle n’est pas manipulée dans une hotte.
- Avant d’anesthésier les mouches, préparez 50 ml de solution Carnoy en ajoutant 15 ml de chloroforme et 5 ml d’acide acétique glacial à 30 ml d’éthanol à 99 % (ne mélangez pas le chloroforme et l’acide acétique). Versez-le dans un récipient en verre à fond plat, comme un plat de cristallisation, pour vous assurer que les colliers peuvent reposer à plat et sont complètement recouverts par la solution.
- Anesthésiez les mouches avec du CO2 ou de l’éther.
- Le fil vole (jusqu’à 20 avec la plupart des colliers) par le cou dans les colliers à l’aide de pinces. N’oubliez pas d’aligner toutes les têtes dans la même orientation, comme on le voit dans Figure 1A, et soyez doux pour vous assurer qu’aucun dommage ne se produit à la tête ou aux yeux.
- Incluez des mouches sinusoïdales (flèches, Figure 1A) à des positions aléatoires afin que l’ordre des mouches puisse être facilement identifié dans les sections. De plus, si les mouches expérimentales ont des yeux clairs ou blancs, enfilez des mouches aux yeux rouges, comme le type sauvage, entre elles pour vous assurer qu’il y a suffisamment de pigment pour colorer la lame. Notez l’ordre des mouches sur une feuille de protocole avec le numéro du collier si vous utilisez plus d’un collier.
- Une fois qu’un collier a été terminé, placez-le dans la solution Carnoy préparée pendant 3,5 à 4 h.
- Versez la solution Carnoy dans le bidon d’élimination approprié et commencez les lavages à l’éthanol. Assurez-vous de verser lentement afin de ne pas perturber le placement des colliers dans le récipient.
- Lavez deux fois les colliers pendant 30 min avec de l’éthanol à 99 %.
- Lavez les colliers à 100 % éthanol pendant 1 h. Assurez-vous de changer les lavages à temps pour éviter une déshydratation excessive.
- Mettez les colliers dans du méthylbenzoate O/N à RT. Fermez le récipient avec du parafilm pour empêcher l’évaporation du méthylbenzoate.
- Versez le méthylbenzozate dans le récipient jetable approprié dans la hotte. Ajouter un mélange préalablement préparé de cire de paraffine à faible point de fusion 1:1 (56 - 57 °C) et de méthylbenzoate. À partir de ce moment, les colliers doivent être conservés dans un incubateur à 65 °C pour s’assurer que la paraffine ne durcit pas.
- Versez le mélange de méthylbenzozate et de paraffine dans le récipient jetable approprié et versez de la cire de paraffine pure fondue, maintenue à 65 °C, sur les colliers.
- Changez la paraffine après 30 minutes et répétez l’opération au moins 5 fois. Au moins 6 à 8 lavages doivent être effectués.
- Une fois les lavages terminés, placez les colliers dans un bac à glaçons en caoutchouc avec des fentes à peu près de la taille des colliers. Versez de la paraffine fondue dessus jusqu’à ce qu’ils soient complètement recouverts et laissez-les durcir O/N (essayez d’éviter les bulles d’air).
- Retirez les blocs de paraffine contenant les colliers du bac à glaçons. Séparez le bloc de paraffine du collier à l’aide d’une lame de rasoir, en cassant doucement le collier. Les têtes seront dans le bloc de paraffine tandis que les corps resteront dans le collier. Les blocs peuvent être conservés à température ambiante.
- Pour nettoyer les colliers, trempez-les dans un agent déparafinisant à 65 °C pour éliminer la paraffine, nettoyez-les avec un léger frottement et lavez-les à l’éthanol avant de les réutiliser.
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