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Ce protocole est un extrait de Bantel et Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Famine
- Préparez des flacons de vaccination contre les mouches en saturant une boule de coton avec 18,2 MΩ d’eau au fond d’un flacon standard. De même, saturez une petite bande de papier filtre avec de l’eau de 18,2 MΩ et placez-la à un angle à l’intérieur du flacon.
- Collectez les mouches en ensembles de ~100 animaux sur un tampon deCO2, puis ajoutez les mouches dans un flacon préparé.
REMARQUE : Les meilleurs résultats sont obtenus avec des animaux de moins de 5 jours. Cependant, l’âge exact des animaux peut être contrôlé en tant que variable expérimentale pour déterminer les changements de préférence gustative au fil du temps.
- Utilisez une boule de coton ou un bouchon en mousse pour fermer les flacons. Placez les flacons sur le côté dans un incubateur à environnement contrôlé. Maintenez la température à 25 °C et l’humidité au-dessus de 70 %. Laissez les flacons intacts pendant 24 heures.
2. Dosage de la préférence gustative
- Préparez tous les échantillons pour le test le même jour que le test.
REMARQUE : Les goûts exacts à utiliser varieront en fonction de la question expérimentale posée. Voici des exemples de dégustations utilisées dans ce protocole. Voir la section 4 pour les optimisations.
- Préparez le savourateur témoin (1 mM de saccharose) en combinant 10 μl de solution de saccharose 100 mM, 13 μl de colorant alimentaire rouge et 977 μl d’eau 18,2 MΩ.
- Préparez le savoureux expérimental (5 mM de saccharose) en combinant 50 μl de solution de saccharose 100 mM, 10 μl de colorant alimentaire bleu et 940 μl d’eau 18,2 MΩ.
- Fabriquer des chambres d’essai à l’aide d’une boîte de Pétri en plastique standard de 100 mm x 15 mm, préparée de la manière suivante :
- Placez trois gouttes de 10 μl de contrôle tastant le plus près du bord de la plaque à 12 heures et 3 autres gouttes à 6 heures. Assurez-vous que l’espacement entre les gouttes est similaire.
- Placez trois gouttes de 10 μl de savourant expérimental le plus près du bord de la plaque à 3 heures et 3 autres gouttes à 9 heures. Assurez-vous que l’espacement entre les gouttes est similaire.
- Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 pour autant de répétitions que vous le souhaitez.
- Vider 1 flacon de ~100 mouches affamées sur un tampon de CO2 juste assez longtemps pour anesthésier tous les animaux (environ 10 sec). Brossez les animaux au milieu d’une chambre de test préparée et couvrez avec le couvercle du plat.
REMARQUE : Des périodes plus longues d’exposition au CO2 doivent être évitées pour améliorer le temps de récupération et limiter les interférences avec le comportement alimentaire. L’exposition à la glace (~5 min) peut être utilisée pour l’anesthésie afin d’éviter les effets comportementaux du CO2 qui peuvent résulter d’une exposition même limitée.
- Placez la chambre de dosage dans une boîte en carton opaque. Assurez-vous d’étiqueter l’extérieur de la boîte avec l’état et le génotype testés.
- Placez l’ensemble de l’installation (chambre de dosage contenue dans la boîte en carton de l’étape 2.4) dans un incubateur à 25 °C avec au moins 70 % d’humidité pendant 2 heures.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour toutes les répétitions.
- Après 2 heures, placez les chambres de dosage, toujours contenues dans des boîtes en carton, directement dans un congélateur à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être quantifiées.
3. Quantification du dosage de la préférence gustative
- Laisser une seule chambre de dosage se réchauffer à température ambiante (environ 5 min).
- À l’aide d’un microscope de dissection, à l’aide d’une brosse ou d’une pince, regroupez les animaux en fonction de la couleur de leur abdomen : rouge, bleu, violet ou clair (Figure 1).
- Notez le nombre d’animaux dans chaque groupe. Considérez que les animaux évidents n’ont pas participé à l’essai et, par conséquent, ne les incluez dans aucun calcul.
- Calculez l’indice de préférence selon l’une des équations suivantes :
- Si le goût expérimental d’intérêt est ajouté au colorant rouge, utilisez (Nrouge + 0,5Nviolet)/(Nrouge + Nbleu + Nviolet).
- Si le goût expérimental est ajouté au colorant bleu, ajustez l’équation à (Nbleu + 0,5Nviolet)/(Nbleu + Nrouge + Nviolet).
- Répétez les calculs pour toutes les conditions expérimentales et les répétitions.
4. Optimisation du dosage de la préférence gustative
- Déterminer empiriquement la concentration des indicateurs de colorant alimentaire à utiliser afin que le colorant alimentaire n’affecte pas le résultat du test de goût, comme suit :
- Préparez 4 dégustations en utilisant le même composé de base (par exemple 5 mM de saccharose) comme indiqué à l’étape 2.1, mais omettez le colorant alimentaire.
- Ajoutez 1,3 % de colorant alimentaire rouge à l’un des goûts. Préparez les 3 dégustations restantes avec du colorant alimentaire bleu de concentrations variables dans chaque tube (par exemple 0,6 %, 1 % et 1,3 %).
- Complétez les étapes 2.2 à 3.4 du protocole pour chaque paire de goût : 1,3 % de rouge contre 0,6 % de bleu ; 1,3 % de rouge contre 1 % de bleu et 1,3 % de rouge contre 1,3 % de bleu.
- Répétez les étapes 4.1.1 à 4.1.3 avec différents pourcentages de colorant alimentaire bleu jusqu’à ce que la moyenne de l’indice de préférence atteigne une valeur de 0 (Figure 2).
REMARQUE : Comme point de départ, 1,3 % de colorant alimentaire rouge associé à 1 % de colorant alimentaire bleu donne généralement de bons résultats. Si aucune concentration satisfaisante de colorant alimentaire bleu ne peut être associée à un colorant à 1,3 %, les étapes 4.1.1 à 4.1.3 peuvent être répétées avec des concentrations variables de colorant rouge et une concentration constante de colorant alimentaire bleu.
- Analysez toutes les conditions à tester avec les mêmes concentrations optimisées de colorants alimentaires.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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