Ce protocole est un extrait de Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Assemblage et réalisation du dosage du FEeder capillaire
- Si le jeûne n’est pas nécessaire, transférez les mouches expérimentales dans le test par tapopotage ou par sarbacane. Assurez-vous d’inclure trois flacons de contrôle sans mouches pour quantifier l’évaporation.
- Retirez avec précaution l’embout d’une pipette (d’un volume de 2 à 20 μL) qui ferme l’une des ouvertures extérieures et insérez un capillaire en verre rempli, l’extrémité inférieure en premier. Fixez le capillaire en replaçant l’embout de la pipette à côté du capillaire. Si plusieurs solutions alimentaires sont testées, répétez cette procédure en conséquence.
- Placez les extrémités capillaires à l’intérieur de tous les flacons au même niveau pour éviter les biais qui pourraient se produire si les sources de nourriture étaient situées à des hauteurs différentes (3 à 4 cm du couvercle) ; gardez une distance par rapport au papier filtre pour éviter que le capillaire ne fuie en touchant accidentellement le papier filtre ou les différentes viscosités des sources de nourriture.
- Étiquetez l’extrémité supérieure du liquide coloré à l’aide d’un marqueur (début de marque). Pour vous assurer que les différents capillaires peuvent être identifiés, étiquetez-les individuellement à l’aide d’un code couleur ou d’un code à bandes.
- Placez plusieurs tests CAFE préparés dans une boîte en plastique avec une incrustation grillagée et transférez la boîte (Figure 2A) dans un endroit sûr dans des conditions de laboratoire ou dans une chambre climatique à température contrôlée, à lumière et à humidité (paramètres : 25 °C, 60 % d’humidité relative, cycle lumière-obscurité 12 h/12 h) pendant la période expérimentale (par exemple 3 h ou jours).
- Comme le papier filtre de fond sèche si le test est effectué sur plusieurs jours, appliquez de l’eau douce toutes les 24 h via la bonde éponge (100 μL) pour maintenir l’humidité constante à l’intérieur du test. Utilisez quatre flacons séparés (8 cm de hauteur, 3,3 cm de diamètre) remplis de 30 ml de ddH2O comme dispositifs d’humidité et placez-les à côté des dosages CAFE dans la boîte en plastique. Utilisez un couvercle pour la boîte en plastique afin de créer un environnement à humidité contrôlée pendant l’expérience (Figure 2A).
REMARQUE : Une variabilité plus large se produit dans des conditions de laboratoire ; cependant, il est possible d’effectuer le test CAFE à température ambiante (p. ex., dans une salle de classe). L’utilisation d’un dispositif d’humidification (papier filtre, avec ou sans bonde éponge humide, flacons d’eau remplis et couvercle pour la boîte en plastique) est fortement encouragée pour réduire l’évaporation (Figure 2B).
- Remplacez les capillaires par des capillaires fraîchement remplis pour des expériences à long terme toutes les 24 h. Notez les mouches mortes avant chaque intervalle de 24 heures et utilisez le nombre de mouches vivantes pour calculer la consommation par mouche pour la période suivante. Jetez les anciens capillaires après avoir mesuré le déclin du ménisque (voir 2.1).
REMARQUE : Au cours d’une expérience de 3 heures, nous ne voyons pratiquement pas de mouches mortes. Au cours d’une étude de 4 jours, nous trouvons généralement 1 à 3 mouches mortes.
- À la fin du test ou avant de remplacer le capillaire, marquez le ménisque inférieur du capillaire (fin de marque) avec un marqueur pendant que le test CAFE est toujours en position verticale. Ignorez les données si lafin du repère n’est pas inférieure au repère initial (début du repère). Ne retirez pas le couvercle, car cela pourrait modifier le ménisque.
- Retirez soigneusement les capillaires du test et stockez-les pour la collecte de données. Vérifiez si le liquide à l’intérieur du capillaire a atteint l’extrémité inférieure, sinon jetez les données, car la nourriture n’était pas accessible aux mouches. Rassemblez tous les capillaires par flacon en groupe. Insérez les pointes de pipette non coupées dans toutes les ouvertures pour empêcher les mouches de s’échapper. Démontez l’installation et lavez les flacons, les couvercles et les bouchons d’éponge dans un bain de savon et séchez-les pendant la nuit à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
REMARQUE : Les mouches peuvent être analysées plus en détail après le test. Confirmez l’absorption de nourriture à l’œil nu ou au microscope de dissection.
- Répétez les expériences avec les mêmes génotypes pendant au moins trois jours différents.
2. Collecte et analyse des données
- Mesurez la distance entre ledébut et lafin de la marque sur le capillaire à l’aide d’un pied à coulisse ou d’une règle. Pour transférer des données directement vers une feuille de calcul, utilisez un pied à coulisse numérique connecté USB (Figure 1E). Jetez les capillaires après la mesure.
- Tenez compte de la taille des capillaires pour calculer l’absorption ou l’évaporation des aliments. Prenons l’exemple d’un capillaire de 73 mm de long qui contient 5 μL de solution alimentaire. Une diminution de 14,6 mm du ménisque reflète l’absorption d’une solution de 1 μL. Calculez l’absorption alimentaire à l’aide de la formule suivante :
Absorption de nourriture (μL) = distance mesurée (mm)/ 14,6 mm
- Pour exclure l’effet de l’évaporation sur l’apport alimentaire, calculez l’évaporation moyenne dans les trois flacons témoins (au minimum) sans mouches. Soustrayez cette valeur moyenne de la valeur obtenue pour la consommation alimentaire par les mouches.
- Utilisez la formule suivante pour déterminer la consommation totale par mouche :
Consommation alimentaire (μL) = (Absorption alimentaire [μL] - Perte par évaporation [μL])/nombre total de mouches dans le flacon. Pour les expériences à long terme, utilisez le nombre de mouches vivantes avant le début de l’intervalle de 24 heures.
- Pour tenir compte des différences de taille corporelle, par exemple entre les mouches mâles et femelles, normalisez la consommation alimentaire en fonction du poids corporel (μL de nourriture/mg de mouche).
- Utilisez un logiciel statistique pour l’analyse des données. Pour les données distribuées normalement, utilisez les tests T de Student pour déterminer les différences entre deux groupes de mouches, et utilisez l'ANOVA (analyse de variance) avec les tests de Tukey Cramer post-hoc pour plus de deux groupes. Dans une situation de choix, analysez les différences par rapport au choix aléatoire à l’aide d’un test de signe non paramétrique à un échantillon.
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