Ce protocole est un extrait de Tenenbaum et Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp.(2016).
NOTE : La procédure d’ablation musculaire (Figure 1) est une modification des méthodes précédemment décrites pour la préparation des filets larvaires. Les étapes qui précèdent et suivent l’ablation musculaire sont brièvement décrites et le lecteur est renvoyé aux travaux antérieurs de Brent et coll. (2009) et de Karim et Moore J. Vis. Exp. (2011) pour des descriptions plus détaillées.
1. Disséquer la larve dans une solution saline froide
- Préparez une dilution de solution saline HL3.1 froide ou de solution saline HL3.1 froide sans Ca2+ (tableau 1). Placez la larve dans un plat en élastomère de silicone avec juste assez de solution saline froide pour couvrir le fond du plat.
REMARQUE : Nous recommandons d’expérimenter l’utilisation d’une solution saline HL3.1 sans Ca2+ par rapport à une solution saline HL3.1 standard lors de la dissection larvaire. En l’absence de calcium, les contractions musculaires larvaires sont considérablement réduites. Ainsi, les filets larvaires peuvent être plus faciles à manipuler lorsqu’ils sont disséqués dans une solution saline HL3.1 exempte de Ca2+. Cependant, nous constatons que la contraction musculaire crée un espace entre le muscle et l’épiderme, ce qui peut faciliter l’insertion de pinces entre ces tissus tout en minimisant le risque d’endommager l’épiderme. Par conséquent, le standard HL3.1 peut être préférable pour préserver l’intégrité de l’épiderme et des neurones da. Nous obtenons de bons résultats avec l’une ou l’autre solution saline et le choix est laissé à l’utilisateur.
- Positionnez la larve avec le côté ventral vers le haut. La surface ventrale de la larve peut être identifiée par les ceintures dentaires abdominales et la face dorsale par les tubes trachéaux larvaires primaires allant de l’avant vers l’arrière. Étirez la larve dans le sens antéro-postérieur et épinglez la tête et la queue à un plat de dissection en élastomère de silicone à l’aide d’épingles à insectes. À l’aide de ciseaux de dissection fins, coupez le long de la ligne médiane ventrale, en commençant par une extrémité et en progressant vers l’autre.
REMARQUE : Cette orientation préserve le groupe dorsal de neurones da couramment étudié.
- Une fois la larve ouverte, épinglez les quatre coins au plat de dissection comme si vous ouvriez un livre. Utilisez des pinces pour saisir et retirer les organes internes, y compris le SNC, l’intestin et la trachée. Ajustez les goupilles à insectes de manière à ce que le filet soit tendu mais pas étiré au maximum.
REMARQUE : Les muscles sont ancrés à la paroi corporelle aux limites segmentaires. Bien que les muscles recouvrent la majeure partie de la paroi corporelle, ils sont absents dans une région étroite près de la ligne médiane dorsale.
2. Ablation musculaire
- Localisez la ligne médiane dorsale de la larve, où le tissu musculaire est absent. Positionnez une seule broche de pince de manière à ce qu’elle puisse être insérée sous le tissu musculaire dans l’orientation la plus plate possible.
- En commençant par la ligne médiane dorsale, près de la limite antérieure du segment, glissez soigneusement la broche de la pince entre le muscle et l’épiderme, en prenant soin de minimiser le contact entre la pince et l’épiderme.
- Tirez la pince vers le haut pour rompre l’attache du muscle à la paroi du corps à un point d’ancrage. Répétez ce processus pour le(s) hémi-segment(s) restant(s) d’intérêt.
REMARQUE : Ce protocole optimise la préservation de la partie postérieure de chaque champ de dendrites de neurones da. Pour préserver la partie antérieure du champ de dendrites, il est préférable d’insérer la griffe de la pince à l’extrémité postérieure de chaque segment.
- Réajustez les épingles à insectes de manière à ce que le filet de la larve soit étiré au maximum dans toutes les directions.
- Fixez le filet pendant qu’il est encore épinglé au plat de dissection en utilisant du formaldéhyde à 4 % froid et fraîchement préparé dans du PBS pendant 25 min.
- Rincer 5 fois au PBS.
- À l’aide d’une pince, retirez délicatement le tissu musculaire des points d’ancrage restants, en prenant soin de minimiser le contact avec l’épiderme.
- Détachez et retirez le filet du plat de dissection dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Effectuer toutes les étapes subséquentes de lavage, de blocage et de coloration par immunofluorescence, comme décrit précédemment dans Karim et Moore, J. Vis. Exp. (2011).
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