Ce protocole est un extrait de Reimels et Pfleger, Methods to Examination the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Immunohistochimie des glandes lymphatiques larvaires
NOTE : La glande lymphatique est située à environ un tiers de la longueur de l’extrémité antérieure d’une larve, légèrement en dessous du cerveau sur la face dorsale. (Voir flèche dans Figure 1B.) La glande lymphatique flanque le vaisseau dorsal et est plus facilement disséquée attachée aux crochets buccaux ou au cerveau. Les ganglions lymphatiques du troisième stade de type sauvage sont de très petites structures ; Les lobes primaires mesurent environ 100 à 200 m de long. (Voir Figure 2A.)
- Pour obtenir des larves à peu près du même stade de développement pour cet essai, limitez la collecte d’œufs en laissant les femelles pondre pendant une période de temps fixe de 2 à 6 heures.
- Dissection des ganglions lymphatiques
- Pour chaque condition expérimentale, ajouter 1 ml de PBS 1x (tableau 1) dans un puits d’une plaque de 24 puits.
- Ajouter 1 goutte de PBST à 0,1 % (tableau 1) dans chaque puits à l’aide d’une pipette de transfert jetable><.
REMARQUE : Un détergent, tel que le Tween 20, est ajouté pour réduire la tension superficielle, permettant au tissu de couler au fond du puits.
- Placez l’assiette à plat sur de la glace.
- Collectez les larves dans des puits de plats de dissection remplis de 1x PBS.
- Placez un tampon de dissection propre sur une base de stéréomicroscope éclairée. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, placez de petites gouttes de PBST à 0,01 % (tableau 1) sur le tampon. Transférez une larve dans une goutte PBST pour la dissection.
- Tenez la larve à l’aide d’une paire de pinces à environ un quart de la longueur de l’extrémité postérieure, côté dorsal vers le haut.
- Utilisez une autre paire de pinces pour saisir la cuticule immédiatement avant les pinces qui retiennent la larve. Tirez doucement la cuticule vers l’extrémité antérieure jusqu’à ce que les crochets buccaux soient exposés.
REMARQUE : L’objectif est de peler la cuticule sans perturber les structures internes.
- Relâchez la cuticule et utilisez les deux pinces pour couper la larve en deux. Retirez l’extrémité postérieure du PBST drop.
REMARQUE : Si la cuticule ne se décolle pas jusqu’aux crochets buccaux, coupez la larve en deux et retirez l’extrémité postérieure. Utilisez une paire de pinces pour tenir le bord de la cuticule et utilisez l’autre paire de pinces pour pousser les crochets buccaux à travers l’ouverture. Cela inversera la cuticule et exposera les crochets buccaux. Cela peut également être utilisé comme une méthode de dissection alternative.
- Utilisez une paire de pinces pour épingler la cuticule (soit la cuticule ventrale, le rabat de cuticule dorsal ou les deux) pour plus de stabilité.
- Utilisez une autre paire de pinces pour saisir les crochets buccaux exposés et retirez-les doucement.
REMARQUE : Cela séparera la cuticule des structures internes. Idéalement, les disques imaginaux de l’œil/antennaire, le cerveau, la glande annulaire et la glande lymphatique flanquant le vaisseau dorsal resteront attachés aux crochets buccaux.
- Tout en tenant les crochets buccaux, retirez soigneusement les structures indésirables telles que les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin.
REMARQUE : Si le cerveau se sépare des crochets buccaux, la glande lymphatique peut encore être attachée et recueillie avec le cerveau. Dans ce cas, tenez le cordon nerveux ventral au lieu des crochets buccaux.
- À l’aide des crochets buccaux ou du cordon nerveux ventral comme poignée, transférez le complexe disséqué contenant la glande lymphatique dans le puits sur de la glace. Ne pas dépasser 30 min avant la fixation.
- Fixation et immunohistochimie
- Placez la plaque à 24 puits sur la base du stéréomicroscope.
- À l’aide d’une pipette p200, retirez délicatement le PBST du puits.
REMARQUE : Les puits vides et voisins sont utiles pour déposer temporairement des déchets.
- Ajoutez doucement 200 μl de formaldéhyde à 3,7 % (tableau 1) sur le côté du puits et faites tourner la plaque pour vous assurer que les tissus disséqués sont complètement immergés.
- Remettre l’assiette dans la glace pendant 30 min. Si les ganglions lymphatiques expriment une ou plusieurs protéines fluorescentes, gardez la plaque couverte pour éviter le photoblanchiment.
- À l’aide d’une pipette p200, retirez délicatement le fixateur.
- Laver en ajoutant 200 μl de 1x PBS dans le puits et en plaçant la plaque sur un agitateur orbital pendant 5 min à température ambiante. À l’aide d’une pipette p200, retirez soigneusement le fichier PBS.
REMARQUE : Les ganglions lymphatiques fixes peuvent être laissés sur la glace dans le PBS jusqu’à ce que les ganglions lymphatiques de toutes les conditions expérimentales soient disséqués et fixés.
- Répétez les étapes de lavage deux fois de plus.
- Ajouter une solution de perméabilisation de 200 μl (tableau 1) dans le puits. Réglez la plaque sur un agitateur orbital pendant 45 min à RT.
NOTE : 45 min est le « gold standard » pour la perméabilisation des glandes lymphatiques mais les auteurs ont réussi après seulement 20 min.
- Prélever la solution à l’aide d’une pipette p200.
- Diluer l'anticorps primaire avec une solution d'anticorps (tableau 1) selon les spécifications du fournisseur. Ajoutez une solution d’anticorps primaires de 300 μl dans le puits et assurez-vous que les tissus disséqués sont complètement immergés. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
- Utilisez une pipette p200 pour prélever l’anticorps primaire.
- Laver en ajoutant 200 μl 1x PBS dans le puits et en plaçant la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 min à température ambiante. Utilisez une pipette p200 pour retirer soigneusement le PBS.
- Répétez les étapes de lavage deux fois de plus.
- Diluer l'anticorps secondaire avec une solution d'anticorps selon les spécifications du fournisseur. Ajoutez une solution d’anticorps secondaires de 300 μl dans le puits et assurez-vous que les tissus disséqués sont complètement immergés. Incuber sur un agitateur orbital pendant au moins 2 heures à RT.
- À l’aide d’une pipette p200, retirez l’anticorps secondaire et lavez-le comme décrit aux étapes 1.3.12 et 1.3.13. Ne retirez pas le PBS après le lavage final.
- Montage des glandes lymphatiques
- Nettoyez les lames de microscope en verre avec de l’éthanol à 70 % (tableau 1) et des lingettes pour mouchoirs.
- Pour chaque condition expérimentale, placez une goutte de tampon de montage (Tableau 1) sur la lame de verre.
REMARQUE : Deux conditions s’emboîtent sur une seule glissière. Le volume du tampon de montage dépend du nombre de ganglions lymphatiques à monter. Utilisez 2 μl pour environ 18 à 20 ganglions lymphatiques, 1 μl pour 10 à 12 et 0,5 μl pour 5 ou moins.
- Placez la lame du microscope sur une base de stéréomicroscope éclairée.
- Pour un maximum de deux affections à la fois, transférez toutes les glandes lymphatiques du puits au tampon de montage à l’aide d’une pince, en utilisant les crochets buccaux ou le cordon nerveux ventral comme poignée.
- Espacez uniformément les tissus disséqués dans une forme circulaire ou rectangulaire, en répartissant le tampon de montage dans le processus.
- Pour chacun des tissus disséqués, glissez individuellement une pince de la pince sous le vaisseau dorsal et tirez doucement vers la périphérie du tampon de montage.
REMARQUE : Cela permettra d’extraire la glande lymphatique du reste des tissus disséqués et d’aplatir la glande lymphatique sur le verre.
- À l’aide d’une pince et d’un mouvement de sciage, coupez le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau.
- Déplacez le reste des tissus disséqués vers le côté opposé de la glande lymphatique, sur le bord le plus externe du tampon.
REMARQUE : Les tissus disséqués indésirables finiront par former un périmètre autour des ganglions lymphatiques et serviront de support sur lequel reposera la lamelle.
- Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les ganglions lymphatiques soient séparés des tissus disséqués, en réservant l’un des tissus disséqués indésirables à placer au centre.
- Prenez une lamelle entre deux doigts. Vérifiez que la lamelle est exempte de poussière et d’empreintes digitales. Si nécessaire, utilisez une lingette mouchoir et de l’éthanol à 70 % pour nettoyer la lamelle.
- En vous assurant que le bord de la lamelle est parallèle au bord de la glissière en verre, abaissez soigneusement la lamelle sur le tampon de montage.
REMARQUE : Les lames de microscope peuvent être stockées à 4 °C avant l’imagerie. La durée maximale de conservation dépend de la stabilité des anticorps utilisés. Les plaques à 24 puits peuvent être rincées et réutilisées.
2. Imagerie
- Imagez les hémocytes fixes et les ganglions lymphatiques montés sur un microscope à fluorescence standard ou confocal approprié à un grossissement de 20X ou plus, conformément au manuel d'utilisation du fabricant. Imagez les larves entières sur un stéréomicroscope standard à un grossissement de 2X selon le manuel d'utilisation du fabricant.
- Suivez les instructions du fournisseur de logiciel pour la déconvolution, si vous le souhaitez.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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