Overview
يصف هذا الفيديو الغدة اللمفاوية Drosophila - الموقع الرئيسي لداء الدم في يرقة الذبابة - ويظهر بروتوكولا نموذجيا لتشريح العضو وتركيبه للكيمياء المناعية والتصوير الفلوري.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من ريملز وبفليغر، طرق لفحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في يرقات دروسوفيلا، J. Vis. Exp. (2016).
1. الكيمياء المناعية للغدد الليمفاوية اليرقات
ملاحظة: تقع الغدة الليمفاوية حوالي ثلث الطول من الطرف الأمامي لليرقة أسفل الدماغ قليلا على الجانب الظهري. (انظر السهم في الشكل 1ب.) الغدة الليمفاوية يحيط الأوعية الظهرية ويتم تشريح بسهولة أكبر تعلق على خطاطيف الفم أو إلى الدماغ. البرية نوع, الغدد الليمفاوية نجمة الثالثة هي هياكل صغيرة جدا; الفصوص الأولية هي ما يقرب من 100 - 200 ميكرومتر في الطول. (انظر الشكل 2أ.)
- للحصول على يرقات من نفس المرحلة التنموية تقريبا لهذا الفحص ، قم بتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث بوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2 إلى 6 ساعات.
- تشريح الغدة الليمفاوية
- لكل حالة تجريبية، إضافة 1 مل 1x PBS (الجدول 1) إلى بئر واحد من لوحة 24 جيدا.
- إضافة 1 قطرة من 0.1٪ PBST (الجدول 1) إلى كل بئر باستخدام ماصة نقل المتاح.
ملاحظة: يتم إضافة المنظفات ، مثل Tween 20 ، لخفض التوتر السطحي ، مما يسمح للأنسجة بالغرق إلى قاع البئر. - ضع الطبق مسطحا على الثلج.
- جمع اليرقات في تشريح آبار طبق مليئة 1x PBS.
- ضع لوحة تشريح نظيفة على قاعدة مجسمة مضيئة. استخدام ماصة نقل المتاح لوضع قطرات صغيرة من 0.01٪ PBST (الجدول 1) على لوحة. نقل يرقة واحدة إلى قطرة PBST للتشريح.
- عقد اليرقة مع زوج واحد من ملقط ما يقرب من ربع طول من النهاية الخلفية، الجانب الظهري حتى.
- استخدام زوج آخر من ملقط للاستيلاء على قطعة الأمامي فورا إلى ملقط التي تحتجز اليرقة. سحب بلطف لطيف نحو نهاية الأمامي حتى يتم الكشف عن السنانير الفم.
ملاحظة: والهدف من ذلك هو تقشير لطيف دون إزعاج أي هياكل داخلية. - حرروا السفاح واستخدموا كلا ملقطين لقطع اليرقة إلى اثنين. إزالة النهاية الخلفية من إسقاط PBST.
ملاحظة: إذا كان الجلد لا قشر على طول الطريق إلى خطاطيف الفم، وقطع اليرقة في اثنين وإزالة النهاية الخلفية. استخدام زوج واحد من ملقط لعقد حافة لطيف، واستخدام الزوج الآخر من ملقط لدفع خطاطيف الفم من خلال الافتتاح. هذا سوف عكس لطيف وفضح خطاطيف الفم. يمكن استخدام هذا كطريقة تشريح بديلة أيضا. - استخدام زوج واحد من ملقط لتثبيت أسفل الجلد (إما الجلد البطني، رفرف الجلد الظهري، أو كليهما) للاستقرار.
- استخدام زوج آخر من ملقط للاستيلاء على السنانير الفم المكشوفة وسحبها بلطف.
ملاحظة: وهذا سيفصل لطيف من الهياكل الداخلية. من الناحية المثالية ، ستبقى أقراص العين / الهوائيات التصويرية والدماغ والغدة الحلقية والغدة الليمفاوية المحيطة بوعاء الظهر متصلة بخطافات الفم. - في حين لا يزال عقد خطاطيف الفم، وإزالة بعناية الهياكل غير المرغوب فيها مثل الغدد اللعابية، والجسم الدهون، والأمعاء.
ملاحظة: إذا انفصل الدماغ عن خطاطيف الفم، فقد تظل الغدة اللمفاوية متصلة بالدماغ وتجمعه. في هذه الحالة، عقد الحبل العصبي البطني بدلا من السنانير الفم. - باستخدام خطاطيف الفم أو سلك العصب البطني كمقبض ، قم بنقل المجمع التشريحي الذي يحتوي على الغدة الليمفاوية إلى البئر على الجليد. لا تتجاوز 30 دقيقة قبل التثبيت.
- التثبيت والكيمياء المناعية
- ضع اللوحة ذات ال 24 بئرا على قاعدة الجيروسكوب المجسم.
- استخدام ماصة P200 لإزالة بعناية برنامج تلفزيوني من البئر.
ملاحظة: الآبار الفارغة المجاورة مفيدة لإيداع النفايات مؤقتا. - إضافة بلطف 200 ميكرولتر 3.7٪ الفورمالديهايد (الجدول 1) أسفل الجانب من البئر ودوامة لوحة لضمان أن الأنسجة تشريح مغمورة تماما.
- أعد الطبق إلى الثلج لمدة 30 دقيقة. إذا كانت الغدد الليمفاوية تعبر عن البروتين الفلورسنت (ق)، والحفاظ على لوحة مغطاة لمنع photobleaching.
- استخدام ماصة p200 لإزالة التثبيت بعناية.
- غسل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر 1x برنامج تلفزيوني إلى البئر ووضع لوحة على شاكر المداري لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصة P200 لإزالة برنامج تلفزيوني بعناية.
ملاحظة: يمكن ترك الغدد الليمفاوية الثابتة على الجليد في برنامج تلفزيوني حتى يتم تشريح الغدد الليمفاوية لجميع الحالات التجريبية وإصلاحها. - كرر خطوات الغسيل مرتين أخريين.
- إضافة 200 ميكرولتر حل permeabilization (الجدول 1) إلى البئر. تعيين لوحة على شاكر المداري لمدة 45 دقيقة في RT.
ملاحظة: 45 دقيقة هو "معيار الذهب" لبيرميلاتيس الغدة الليمفاوية ولكن المؤلفين لديهم النجاح بعد 20 دقيقة فقط. - إزالة الحل مع ماصة P200.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية مع حل الأجسامالمضادة (الجدول 1)وفقا لمواصفات مزود. إضافة 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية إلى البئر وضمان أن الأنسجة تشريح مغمورة تماما. حضانة عند 4 °C بين عشية وضحاها.
- استخدام ماصة P200 لإزالة الأجسام المضادة الأساسية.
- غسل بإضافة 200 ميكرولتر 1x برنامج تلفزيوني إلى البئر ووضع لوحة على شاكر المداري لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصة P200 لإزالة برنامج تلفزيوني بعناية.
- كرر خطوات الغسيل مرتين أخريين.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية مع حل الأجسام المضادة وفقا لمواصفات مزود. إضافة 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية إلى البئر وضمان أن الأنسجة تشريح مغمورة تماما. احتضان على شاكر المداري لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
- استخدام ماصة P200 لإزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل كما هو موضح في الخطوات 1.3.12 و 1.3.13. لا تقم بإزالة برنامج تلفزيوني بعد غسل النهائي.
- تصاعد الغدة الليمفاوية
- الزجاج النظيف الشرائح المجهر باستخدام الإيثانول 70٪ (الجدول 1) ومناديل الأنسجة.
- لكل شرط تجريبي، ضع قطرة واحدة من العازلة المتصاعدة (الجدول 1) على الشريحة الزجاجية.
ملاحظة: شرطين تناسب على شريحة واحدة. حجم التخزين المؤقت المتصاعد يعتمد على عدد الغدد الليمفاوية التي سيتم تركيبها. استخدام 2 ميكرولتر لحوالي 18-20 الغدد الليمفاوية، 1 ميكرولتر لمدة 10-12، و 0.5 ميكرولتر لمدة 5 أو أقل. - ضع شريحة المجهر على قاعدة مجسمة مضيئة.
- لمدة تصل إلى شرطين في وقت واحد، نقل جميع الغدد الليمفاوية من البئر إلى العازلة المتصاعدة مع ملقط، وذلك باستخدام خطاطيف الفم أو الحبل العصبي البطني كمقبض.
- الفضاء الأنسجة تشريح بالتساوي في شكل دائري أو مستطيل، ونشر العازلة تصاعد في هذه العملية.
- لكل من الأنسجة تشريح، على حدة، الشريحة واحد تونغ من ملقط تحت السفينة الظهرية وسحب بلطف نحو محيط العازلة تصاعد.
ملاحظة: وهذا سوف يوجه الغدة الليمفاوية من بقية الأنسجة تشريح وتسطيح الغدة الليمفاوية على الزجاج. - باستخدام ملقط واحد من ملقط وحركة منشار، وقطع الأوعية الظهرية بين الغدة الليمفاوية والدماغ.
- نقل بقية الأنسجة تشريح إلى الجانب الآخر من الغدة الليمفاوية، على الحافة الخارجية من المخزن المؤقت.
ملاحظة: ستشكل الأنسجة التشريحية غير المرغوب فيها في نهاية المطاف محيطا حول الغدد الليمفاوية وتعمل كدعم يستريح عليه الغطاء. - كرر حتى يتم فصل جميع الغدد الليمفاوية من الأنسجة تشريح، وحجز واحدة من الأنسجة تشريح غير المرغوب فيها لوضعها في المركز.
- خذ غطاء بين إصبعين. تأكد من خلو غطاء الغطاء من الغبار وبصمات الأصابع. إذا لزم الأمر، استخدم مسح الأنسجة والإيثانول 70٪ لتنظيف الغطاء.
- التأكد من أن حافة الغطاء موازية لحافة الشريحة الزجاجية، خفض الغطاء بعناية فوق المخزن المؤقت المتصاعد.
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح المجهر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل التصوير. يعتمد الحد الأقصى لوقت التخزين على استقرار الأجسام المضادة المستخدمة. يمكن شطف 24 لوحة جيدا وإعادة استخدامها.
2. التصوير
- صورة خلايا الدم الثابتة والغدد الليمفاوية المركبة على مضان قياسي مناسب أو مجهر كونفوكوكال عند 20X أو تكبير أعلى وفقا لدليل التشغيل الخاص بالشركة المصنعة. صورة يرقات كاملة على مجسم قياسي في تكبير 2X وفقا لدليل التشغيل الخاص بالشركة المصنعة.
- اتبع تعليمات موفر البرنامج لdeonvolution، إذا رغبت في ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: في فيفو كريستال الخلية الميلانين. أ) تم وضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب PCR قبل التدفئة. تشير الأسهم الحمراء إلى اليرقات التي ليست في أسفل الأنابيب. ب) نمط يلة الخلايا البلورية النموذجية بعد التدفئة ، والذي يكشف في بعض الأحيان عن الغدة الليمفاوية (السهم ؛ الجانب الظهري هو مبين ، يتم ترك الأمامي). يمثل شريط المقياس 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكيمياء المناعية للغدد الليمفاوية اليرقات. أ) صورة DIC لغدة ليمفاوية يرقات نجمية ثالثة تظهر الأوعية الظهرية (dv) والفص الأولي (1 درجة) والفص الثانوي (2 درجة). يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. ب) غدة ليمفاوية يرقات نجمية ثالثة ممثلة من يرقة تعبر وراثيا عن EBFP2 في منطقة النخاع وGFP في مركز الإشارات الخلفي. كانت الغدة اللمفاوية ملطخة بأجسام مضادة ضد نطاق الشق داخل الخلايا (أحمر). صورة غير معدلة مأخوذة بمجهر مضان (أعلى). نفس الصورة بعد deconvolution (أسفل). تمثل أشرطة المقياس 20 ميكرومترا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
