Ce protocole est un extrait de Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).
1. Préparation de la station de dissection
- Placez le stéréomicroscope et la source lumineuse avec les cols de cygne à fibre optique fixés sur une grande paillasse. Pour favoriser des mouvements stables de la main et réduire les « tremblements » de la main lors de la dissection, il est essentiel de disposer d’un espace adéquat pour les mains et les bras autour du microscope. Assurez-vous qu’il y a environ 8 à 10 pouces de chaque côté du microscope et 4 à 6 pouces entre la base du microscope et le bord de la paillasse.
- Remplissez 2 ou 3 puits d’un plat en verre à 9 ou 3 puits avec 1,0 mL de tampon PTN (tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2, tensioactif non ionique à 0,1 %, voir le tableau des matériaux pour les composants complets du tampon) et placez-le à côté de la station de dissection sur de la glace. Les cerveaux nouvellement disséqués seront transférés dans cette boîte et stockés jusqu’à l’étape de fixation.
REMARQUE : Si une imagerie en direct est nécessaire, le tampon de dissection doit être 1 tampon salin tamponné au phosphate (PBS) ou un tampon HL3. Si la localisation des protéines intracellulaires est nécessaire, le PBS peut également être utilisé comme tampon alternatif pour la dissection et la fixation. Après la fixation, la perméabilisation des membranes cellulaires doit ensuite être effectuée à l’aide de lavages PTN contenant 0,1 % ou 0,3 % de détergent non ionique.
- Si le PBS est utilisé pour les dissections et la fixation, les pointes de pipette doivent être rincées au moins une fois avec un tampon contenant un détergent (tel que le PTN) pour éviter que la cervelle ne colle aux pointes de pipette en plastique lors du transfert dans les tubes de microcentrifugation.
- À l’aide d’une boîte de Pétri vide en verre ou en plastique de 35 mm, construisez une boîte de dissection contenant un élastomère de silicone. Mélangez brièvement les composants de l'élastomère selon les instructions du fabricant, versez-les dans des plats de 35 mm et laissez-le polymériser pendant la nuit sur une surface plane. Des boîtes de dissection contenant de l’élastomère doivent être utilisées pour protéger les pointes fines des pinces à dissection, qui peuvent facilement être endommagées si un contact est établi entre la pince et une surface plus dure, telle qu’une boîte en verre. Nous achetons également régulièrement de la vaisselle recouverte de silicone disponible dans le commerce auprès de détaillants en ligne. Pour augmenter le contraste lors des dissections, les boîtes de dissection en élastomère de silicone contenant du charbon inactif (et donc de couleur noire) sont particulièrement utiles.
2. Procédure de dissection cérébrale chez l’adulte
- Anesthésier D. melanogaster adulte de 3 à 5 jours avec du CO2 ou à l’aide de glace. Si vous utilisez de la glace, placez le flacon contenant les mouches à l’envers (extrémité de la fiche vers le bas) dans un seau à glace pendant ~5 min. Placer le flacon dans de la glace à l’envers empêche les mouches de se loger dans la nourriture. Une fois que les mouches ont été anesthésiées, placez-les sur un tampon métallique froid ou une boîte de Pétri posée dans de la glace ou sur un coussin anti-mouches émetteur de CO2. Si l’on dissèque des cerveaux pour analyser la neurodégénérescence, des mouches plus âgées peuvent également être utilisées.
- Placez une petite quantité (150 - 200 μL) de PTN au centre de la boîte de dissection à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pipette p200 pour créer une « bulle » de PTN. Placez la parabole de dissection sous le stéréomicroscope et ajustez l’éclairage et la mise au point de manière à ce que la bulle de PTN remplisse le champ de vision et soit uniformément éclairée.
- Manipulez les mouches de manière à ce qu’elles soient « ventrale vers le haut » (c’est-à-dire face ventrale vers le haut) lorsqu’elles sont couchées sur le métal ou le coussin de CO2.
- À l’aide d’une paire de pinces #5, saisissez l’abdomen d’une mouche à disséquer et, en gardant la mouche, immergez-la complètement dans le PTN sur la boîte de dissection.
REMARQUE : Pour le reste du protocole, toutes les étapes doivent être effectuées pendant que la tête est immergée dans le PTN.
- À l’aide d’une deuxième paire de pinces #5, saisissez la base de la trompe de mouches et écartez les deux paires de pinces pour détacher la tête de la mouche du corps. Jetez l’abdomen et le thorax. Au cours de cette étape, il est essentiel que la tête ne soit pas relâchée et laissée flotter à la surface du PTN. Une fois que la tête flotte, il peut être très difficile de la saisir à nouveau sans écraser le cerveau.
REMARQUE : En utilisant cette méthode, les connexions entre le cerveau et le cordon nerveux ventral sont sectionnées. Si des connexions intactes entre ces régions du SNC sont nécessaires, un protocole de dissection alternatif doit être suivi. Si la trompe se détache de la tête de mouche avant que celle-ci ne soit retirée, il y aura un trou à l’endroit où se trouvait la trompe. Dans ce cas, saisissez la tête de mouche au bord du trou près d’un œil. Retirez ensuite la tête en utilisant une force modérée tout en écartant les deux paires de pinces l’une de l’autre. Parfois, lorsque la tête est retirée du corps, le cordon nerveux intestinal et/ou ventral reste attaché à la tête et doit être retiré avant de poursuivre la dissection.
- Alors qu’une paire de pinces saisit la trompe, la deuxième paire doit saisir le bord médial de l’œil de la mouche droite. Lentement, écartez les pinces l’une de l’autre. Cette étape doit être effectuée avec une petite quantité de force latérale constante. Au fur et à mesure que les pinces s’écartent l’une de l’autre, la trompe doit se détacher de la tête et créer un trou central dans la cuticule de la tête. Jetez la trompe avec la première paire de pinces sans relâcher la partie médiale de l’œil droit de la deuxième paire.
REMARQUE : Le cerveau adulte de D. melanogaster se trouve dans la région caudale (c.-à-d. postérieure/arrière) de la tête de mouche. Ainsi, il faut éviter de saisir cette région de la tête. Idéalement, seule la partie rostrale (c’est-à-dire avant) de la tête près de la rétine médiale devrait être saisie directement par la pince. Le cerveau et la trachée associée devraient maintenant être visibles à travers le trou central de la cuticule. À ce moment-là, tous les fils filandreux blancs de la trachée qui dépassent du trou peuvent être retirés et jetés.
- Avec la deuxième paire de pinces, saisissez le bord médial de la rétine gauche (au bord du trou central de la cuticule de la tête). Pour retirer les rétines et la cuticule associée, éloignez lentement les pinces l’une de l’autre à un angle de 180°. Au fur et à mesure que la rétine se dissocie du lobe optique sous-jacent, vous devriez ressentir une légère diminution de la tension. Procédez lentement pour éviter de déchirer le lobe optique.
REMARQUE : Une séparation trop rapide des pinces au cours de cette étape peut entraîner la déchirure du lobe optique ou la perturbation des structures corporelles des champignons. Parfois, la cuticule sera retirée, mais des morceaux de la rétine resteront attachés au lobe optique. Si vous imagez les corps des champignons, il n’est pas complètement nécessaire d’enlever toute la rétine. Cependant, l’analyse d’autres régions du cerveau (telles que l’innervation des neurones rétiniens des lobes optiques du cerveau) peut nécessiter l’ablation complète de la rétine, comme décrit par.
REMARQUE : Comme la rétine est lentement séparée du lobe optique sous-jacent du cerveau, le lobe optique devrait être observable sous la forme d’une structure blanche opaque recouverte d’une trachée blanche et filandreuse. Une fois qu’une rétine a été enlevée, elle peut être jetée. Lors de l’analyse de la recherche de trajectoire des neurones rétiniens, une attention particulière doit être prise au cours de cette étape pour éviter d’endommager le lobe optique. Un protocole supplémentaire axé sur la dissection et l’imagerie en direct des neurones photorécepteurs est également disponible.
- Maintenant, retirez avec précaution la plus grande partie possible de la trachée visible. La trachée peut déjà contenir ou se remplir plus tard d’air, ce qui fait flotter le cerveau et, potentiellement, être perdu lors des étapes ultérieures de l’immunomarquage. Pour enlever la trachée, retirez-la du cerveau à l’aide d’une paire de pinces #5 très tranchantes.
- Retirez le reste de la rétine et la cuticule environnante à l’aide des deux paires de pinces pour saisir la région médiale de la rétine de la mouche gauche. Déchirez soigneusement la rétine en deux pour enlever des morceaux de la rétine et de la cuticule. Dans certains cas, l’élimination de la cuticule restante sans écraser le cerveau s’avère particulièrement difficile. Dans ces cas, nous avons constaté que les brins restants du cordon nerveux ventral peuvent être saisis par une paire de pinces tandis que l’autre paire de pinces est utilisée pour retirer soigneusement le dernier morceau de cuticule.
- À l’aide d’une pipette p200, déplacez les cerveaux disséqués dans un puits de la boîte à 9 ou 3 puits contenant le PTN. Les cerveaux du même génotype doivent être regroupés dans le même puits et conservés sur de la glace. Le tissu cérébral doit être réparé dans l’heure qui suit la dissection. Les cerveaux peuvent être réparés en petits lots et mis en commun si un plus grand nombre de cerveaux est nécessaire. Dans la plupart des cas, un chercheur expérimenté peut disséquer un cerveau et le transférer dans la boîte de collecte en verre en environ 3 à 5 minutes.
