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Ce protocole est un extrait de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp.(2016).
1. Préparer les cages de ponte
- Préparez des assiettes d'agar au jus de raisin en faisant cuire au micro-ondes 100 ml d'eau, 10 g de levure de bière, 10 g de glucose et 1 g d'agar. Portez à ébullition 3 fois à l’étape 1.1 et ajoutez 10 g de concentré de jus de raisin congelé pour augmenter la visibilité des œufs sur la plaque de gélose.
- Lorsque la gélose a refroidi à 55 °C, verser 20 ml dans des boîtes de Pétri de 100 mm et laisser se solidifier.
- Recouvrez la surface des plaques de gélose d'une pâte de levure en mélangeant 1 g de levure de bière avec 15 g d'eau. Versez la pâte de levure sur la plaque de gélose en vous assurant que la surface est couverte, puis videz l’excédent en laissant un mince résidu de levure. Si plusieurs plaques sont utilisées, la pâte peut être versée séquentiellement sur plusieurs plaques.
- Transférez les plaques de gélose au fond d’une cage.
REMARQUE : Un contenant de charcuterie de 32 oz est un bon substitut aux cages à mouches en acrylique.
- Faites des couvercles pour les contenants de charcuterie de 32 oz en découpant un trou dans le haut et en collant un filet respirant sur le trou avec de la colle non toxique. Si la colle est soluble dans l’eau, évitez l’exposition de l’eau au couvercle.
- Transférez 200 à 300 mouches dans le récipient et couvrez avec un couvercle. Couvrez le trou protégé par un filet avec un couvercle de boîte de Pétri vide pour éviter l’évaporation de la surface de la gélose et ajoutez un papier de soie humide à l’intérieur du couvercle si vous le souhaitez. Incuber les mouches à 25 °C pendant la nuit pendant 16 à 20 heures.
2. Collecter les œufs
- Préparez un tamis pour la collecte des œufs en plaçant un treillis de nylon dans une douille en plastique.
- Pour récupérer la plaque avec des œufs dessus, retirez les mouches de la cage en les transférant dans un récipient vide. Si les mêmes mouches sont utilisées le lendemain, transférez-les immédiatement dans une nouvelle cage contenant une plaque de gélose au jus de raisin fraîchement levée. Les mouches peuvent être utilisées pendant 3 à 5 jours consécutifs
- Retirez les mouches mortes de l’agar avec un pinceau propre, en faisant attention de ne pas briser l’agar.
- Récupérez les œufs en rinçant la plaque de gélose avec de l’eau distillée, en brossant doucement les œufs de la surface de la gélose et en versant la bouillie sur le grillage. Répétez 3 à 4 fois jusqu’à ce que tous les œufs ou la plupart aient été retirés de la plaque de gélose.
3. Déchorionner les œufs et les transférer à un régime stérile
- Préparez l’enceinte de biosécurité en vaporisant l’intérieur (y compris les côtés) avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez le fond avec un mouchoir de laboratoire et stérilisez la cagoule avec une lumière UV pendant ~15 min. Stérilisez toutes les fournitures non biologiques (gobelets à échantillons, pinceau, pinces, récipient à déchets, 400 ml d’eau stérilisée et 100 ml d’hypochlorite de sodium à 0,6 %) en les vaporisant de l’éthanol et en les plaçant immédiatement dans l’enceinte de sécurité biologique. Stériliser à la lumière UV pendant 15 min.
- Commencez le premier des 2 lavages à l’hypochlorite de sodium en plaçant la douille avec les œufs dans un gobelet à échantillons de 120 ml ou un autre récipient stérile. Versez lentement ~90 ml de solution d’hypochlorite de sodium à 0,6 % dans la douille jusqu’à juste en dessous du rebord.
- Rincer les œufs pendant 2,5 min. Remettre périodiquement les œufs en suspension à l’aide d’une pince pour déplacer la douille de haut en bas dans la solution d’hypochlorite.
- Transférez la douille directement dans un deuxième gobelet d’échantillon, pré-rempli de 90 ml d’eau de Javel, à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
- Répétez l’étape 3.3 à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. À la fin du deuxième traitement à l’eau de Javel, les œufs doivent commencer à adhérer aux côtés de la bague.
- Effectuez les étapes 3.7-3.8 dans l’enceinte de biosécurité.
- Jetez l’eau de Javel et lavez la douille à l’eau stérile 3 fois. Remettez les œufs en suspension plusieurs fois lors de chaque lavage en déplaçant la douille à l’aide d’une pince. À la fin du troisième lavage, la plupart des œufs doivent être attachés sur le côté de la bague.
- À l’aide d’un pinceau stérilisé à l’éthanol, transférez les œufs du côté de la douille à la ration stérile. Transférez les œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30 à 50 œufs par flacon. Laissez les capuchons desserrés pour permettre à l’oxygène de pénétrer dans le tube.