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Ce protocole est un extrait de Koyle et al., Raising the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Déchorionner les œufs et les transférer dans un régime stérile
- Préparez l’enceinte de biosécurité en vaporisant l’intérieur (y compris les côtés) avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez le fond avec un mouchoir de laboratoire et stérilisez la cagoule avec une lumière UV pendant ~15 min. Stérilisez toutes les fournitures non biologiques (gobelets à échantillons, pinceau, pinces, récipient à déchets, 400 ml d’eau stérilisée et 100 ml d’hypochlorite de sodium à 0,6 %) en les vaporisant de l’éthanol et en les plaçant immédiatement dans l’enceinte de sécurité biologique. Stériliser à la lumière UV pendant 15 min.
- Commencez le premier des 2 lavages à l’hypochlorite de sodium en plaçant la douille avec les œufs dans un gobelet à échantillons de 120 ml ou un autre récipient stérile. Versez lentement ~90 ml de solution d’hypochlorite de sodium à 0,6 % dans la douille jusqu’à juste en dessous du rebord.
- Rincer les œufs pendant 2,5 min. Remettre périodiquement les œufs en suspension à l’aide d’une pince pour déplacer la douille de haut en bas dans la solution d’hypochlorite.
- Transférez la douille directement dans un deuxième gobelet d’échantillon, pré-rempli de 90 ml d’eau de Javel, à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
- Répétez l’étape 1.3 à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. À la fin du deuxième traitement à l’eau de Javel, les œufs doivent commencer à adhérer aux côtés de la bague.
- Effectuez les étapes 1.7-1.8 dans l’enceinte de biosécurité.
- Jetez l’eau de Javel et lavez la douille à l’eau stérile 3 fois. Remettez les œufs en suspension plusieurs fois lors de chaque lavage en déplaçant la douille à l’aide d’une pince. À la fin du troisième lavage, la plupart des œufs doivent être attachés sur le côté de la bague.
- À l’aide d’un pinceau stérilisé à l’éthanol, transférez les œufs du côté de la douille à la ration stérile. Transférez les œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30 à 50 œufs par flacon. Laissez les capuchons desserrés pour permettre à l’oxygène de pénétrer dans le tube. Si les flacons doivent rester axéniques, transférez-les dans un incubateur d’insectes ; Sinon, ajoutez des bactéries comme ci-dessous.
2. Fabriquer des mouches gnotobiotiques en utilisant 4 espèces bactériennes
- Préparer les bactéries
- Préparez une enceinte de biosécurité stérilisée avec les fournitures nécessaires (pipettes, boîtes d’embouts de pipette, tubes à centrifuger stérilisés, bouillon MRS et supports de tubes à essai) comme à l’étape 1.1. Essuyez l’extérieur des tubes à essai avec une lingette de laboratoire imbibée d’éthanol avant de les placer dans une enceinte de biosécurité.
- Granulez les bactéries en transférant d’abord 500 μl de croissance nocturne dans un tube de microfuge stérile. Si la densité bactérienne est faible, ajoutez jusqu’à 1,5 ml dans chaque tube ou retirez séquentiellement le surnageant et ajoutez une culture supplémentaire dans le même tube. Retirer les échantillons de l’enceinte de sécurité biologique et centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g. Utilisez des pointes filtrantes pour éviter la contamination entre les échantillons.
- Déterminez la densité de chaque culture en mesurant OD600. Si vous utilisez un lecteur de plaques multipuits, transférez 200 μl de chaque culture dans une plaque de 96 puits en dilutions de 1, 2 et 4 fois.
- Déterminer la quantité d’ARMm dans laquelle diluer chaque pastille cellulaire (2.1.2) à l’aide d’un spectrophotomètre à lecture de plaque et des équations suivantes. Prévoyez d’ajouter suffisamment de bouillon pour inoculer 50 μl à chaque flacon de mouches.
- Recueillir des lectures de DO600 pour une dilution de 1:1, 1:2 et 1:4 de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre à lecture de plaques. Sélectionnez la dilution pour chaque souche bactérienne qui produit une valeur de DO600 comprise entre 0,1 et 0,2 et utilisez cette valeur et son facteur de dilution correspondant comme « O » et « D » dans les formules données en 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
- Si vous utilisez les 4 espèces décrites ici, normalisez les cellules aux densités équivalentes d’unité de formation de colonies (UFC)/ml (conversion deDO 600 en UFC déterminée précédemment dans Newell et Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) à l’aide de l’équation suivante :
E = ((O-B) x V x D)/C
où E = volume pour remettre la pastille en suspension (μl), O = DO600 bactéries, B = DO600 milieux vierges, D = dilution par plis, V = μl culture bactérienne avant centrifugation, C = DO600 de constante prédéterminée. Voir le fichier de code supplémentaire pour des exemples de calculs à l’aide de ces équations. Pour les spectrophotomètres qui se vident automatiquement, utilisez « O » à la place de « O-B ».
REMARQUE : Les constantes prédéterminées (unités OD600, normalisées à 107 UFC ml-1, constantes dérivées de Newell et Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) sont les suivantes : A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- Si vous utilisez d’autres espèces bactériennes (aucune constante UFC/DO600 n’est disponible), normalisez la densité àDO 600 = 0,1 à l’aide de cette équation :
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
REMARQUE : Les unités sont les mêmes qu’à l’étape 2.1.4.2. Voir le fichier de code supplémentaire pour des exemples de calculs à l’aide de ces équations.
- Dans l’enceinte de biosécurité, retirer le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et remettre la pastille en suspension dans du SMRm ou du PBS frais, comme calculé à l’étape 2.1.4.2.
- Inoculer des bactéries
- Transférez 50 μl de bactéries dans les tubes coniques avec un régime stérile et des œufs déchotionnés dans une enceinte de biosécurité. Ajoutez des bactéries après le transfert des œufs pour éviter la contamination entre les flacons.
- Placez les tubes inoculés dans un incubateur à 25 °C.
3. Mesurer la charge CFU/Tester la stérilité
- Pour mesurer la charge d’UFC dans les homogénats de mouches du corps entier, transférez 5 mouches (5 à 7 jours après l’éclosion) dans un tube de microfuge de 1,7 ml contenant 125 μl de billes de céramique et 125 μl de bouillon MRMm. Homogénéiser les mouches à l’aide d’un homogénéisateur de tissus pendant 30 secondes à 4,0 M/s.
- Vous pouvez également omettre les billes et homogénéiser à la main dans des tubes de microcentrifugation avec des pilons en plastique pendant 1 min.
- Si vous quantifiez le microbiote intestinal, stérilisez les mouches en surface pour éliminer les microbes exogènes. Transférez les mouches dans un tube de microcentrifugation contenant 100 μl d’éthanol à 70 % pendant 1 min, aspirez l’éthanol et transférez-les dans un nouveau tube de microcentrifugation pour les homogénéisations. Si la teneur en ADN de l’intestin doit être mesurée, rincez pendant 1 minute avec de l’hypochlorite de sodium à 0,6 % avant le lavage à l’éthanol.
- Diluer l’homogénat avec 875 μl d’IRMm, agiter pendant 5 secondes et pipeter 120 μl d’homogénat dans le premier puits d’une plaque de microtitration.
- Effectuez deux dilutions séquentielles de 1:8 en utilisant 10 μl d’homogénat et 70 μl de MRS dans les deux puits suivants.
- Retirez 10 μl du premier puits et ajoutez-le dans le deuxième puits contenant 70 μl de MRS. Mélangez soigneusement le contenu du deuxième puits, transférez 10 μl du deuxième puits au troisième puits contenant 70 μl de MRS et mélangez soigneusement. Cela conduit à 3 concentrations totales de l’homogénat d’origine de 1 000 μl : non dilué, 1:8 et 1:64.
- Transférez 10 μl de chaque dilution dans une plaque d’IRMm (à l’aide d’une pipette multicanaux si vous le souhaitez). Inclinez légèrement le plat pour étaler la dilution sur plusieurs millimètres sur la surface de la gélose et laissez le liquide sécher avant de déplacer la plaque. Le liquide sèche rapidement sur la plaque si les plaques ont 2 jours, réduisant ainsi le mélange de deux gouttelettes voisines.
- Incuber à 30 °C pendant 1 à 2 jours. Retirez les plaques de l’incubateur une fois que des colonies distinctes et individuelles sont visibles, et comptez à partir d’une dilution avec 10 à 100 colonies isolées.
- Calculer l’UFC par mouche à l’aide de l’équation E = C x D/P x V/F, où E = UFC par mouche, C = nombre de colonies comptées, D = dilution, P = μl plaqué, V = volume d’homogénat de mouches et F = nombre de mouches homogénéisées.