Ce protocole est un extrait de Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).
1. Dissection et fixation de la jambe
- Prenez une plaque multi-puits en verre et remplissez le nombre approprié de puits avec de l’éthanol à 70 %. Ajoutez 15 à 20 mouches anesthésiées au CO2 (des deux sexes et de tout âge) dans chaque puits et, à l’aide d’un pinceau, tamponnez doucement les mouches dans la solution d’éthanol jusqu’à ce que les mouches soient complètement immergées.
REMARQUE : Cette étape consiste à supprimer l’hydrophobicité de la cuticule. Ne pas laver plus de 1 min, car cela augmente l’auto-fluorescence de la cuticule.
- Rincez les mouches 3 fois avec une solution détergente tensioactive non ionique à 0,3 % dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez les mouches dans cette solution pendant au moins 10 min.
REMARQUE : Les jambes sont mieux fixées lorsqu’on inclut du détergent, ce qui est susceptible d’augmenter la pénétration du fixateur à l’intérieur de la jambe.
- Placez une plaque multipuits sur la glace avec un tube de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
REMARQUE : La préparation de PFA frais à 4 % à partir d’une solution mère sans éthanol à 16 % de PFA est essentielle.
- À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer la tête et l’abdomen des mouches sans endommager le segment thoracique ou les pattes.
REMARQUE : L’ablation de l’abdomen permet de tenir plus facilement la mouche et de disséquer les pattes.
- Disséquez les pattes du segment thoracique à l’aide d’une pince et placez les pattes dans les puits contenant 4 % de PFA. Pour cela, poussez doucement mais fermement à la jonction coxa-thorax à l’aide de la pointe d’une pince fine jusqu’à ce que la jambe se détache.
- Fixez les cuisses dans 4 % de PFA pendant la nuit à 4 °C (environ 20 h au total).
- Lavez les cuisses avec une solution détergente tensioactive non ionique à 0,3 % en 1x PBS, 5x pendant 20 min chacune.
- Remplacez le tampon de lavage par un support de montage. Conservez la jambe dans le support de montage pendant au moins une journée avant le montage pour permettre sa pénétration complète dans la jambe.
REMARQUE : Si le milieu de montage est très visqueux, diluez le milieu de montage à 80 % avec 1x PBS car le changement soudain de viscosité peut provoquer l’affaissement de la cuticule et endommager la structure globale de la jambe. Selon le pilote Gal4, les mouches peuvent être conservées pendant 1 à 3 semaines à 4 °C dans un support de montage jusqu’au montage.
2. Montage des pieds
- Placez environ 20 μL de glycérol à 70 % sur le côté gauche d’une lame de microscope et recouvrez d’une lamelle carrée de 22 x 22 mm2 (Figure 1A,B). Pipeter environ 10 μL de milieu de montage le long d’une ligne parallèle et à une petite distance du bord droit de cette lamelle. Ajoutez 30 μL supplémentaires de fluide de montage sur le côté droit de la glissière (Figure 1C).
REMARQUE : Lors de l’application d’une lamelle sur les jambes (voir ci-dessous), le support de montage s’étale doucement sous la lamelle et autour des jambes sans les déplacer.
- À l’aide d’une pince fine, soulevez la jambe de la solution et placez-la doucement sur le support de montage près de la lamelle gauche. Faites de même pour chaque jambe et alignez-les de haut en bas (Figure 1D).
- Soulevez et transférez les jambes dans une goutte de milieu maintenue entre les deux pointes de la pince. Orientez les jambes de deux façons : côté externe vers le haut ou vers le bas.
- Une fois que toutes les pattes (jusqu’à 6 à 8 pattes peuvent être montées) sont correctement alignées, placez une deuxième lamelle sur les pattes de sorte que cette lamelle repose légèrement sur la lamelle précédemment placée Figure 1E pour laisser de l’espace entre la lamelle et le tissu et pour éviter que les pattes ne soient endommagées (Figure 1G).
REMARQUE : Vous pouvez également utiliser des puits d’autocollants ou de la cire orthodontique pour créer un espace entre la lamelle et la lame.
- Utilisez un vernis à ongles pour fixer la position des lamelles à chaque coin (Figure 1F).
REMARQUE : Le tissu est maintenant prêt à être imagé.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.