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Ce protocole est extrait de Radford et McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
REMARQUE : Les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Des incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures pour l’élevage et les croisements de mouches, sauf indication contraire.
1. Préparatifs
- Préparez les mouches.
- Collections d’ovocytes enrichies en prométaphase.
- Éliminer les mouches adultes à partir de jeunes animaux sains ou de cultures croisées. Vieillir les bouteilles pendant deux jours à 25 °C.
REMARQUE : Généralement, deux bouteilles saines suffisent, bien que davantage puissent être nécessaires pour certaines cultures croisées.
- Après deux jours, récupérez ~100 à 300 femelles (âgées de 0 à 2 jours à ce stade) dans les bouteilles. Les femelles n’ont pas besoin d’être vierges. Ajoutez une noisette de pâte de levure sur le côté d’une fiole et placez 30 femelles et 10 à 15 mâles chacun dans les flacons à levure. Flacons de vieillissement pendant deux jours à 25 °C.
- Collections d’ovocytes enrichies en métaphases.
- Prélever ~100 à 300 femelles dans des cultures de base ou croisées. Ajoutez une noisette de pâte de levure sur le côté d’une fiole et placez 30 femelles chacune (sans mâles ajoutés) dans les flacons à levure. Laisser vieillir les flacons pendant trois à cinq jours à 25 °C.
- Préparer Solutions.
REMARQUE : Les solutions peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante, sauf indication contraire.
- Préparez le tampon Robb's modifié (5x) : 500 mM d'HEPES, 500 mM de saccharose, 275 mM d'acétate de sodium, 200 mM d'acétate de potassium, 50 mM de glucose, 6 mM de chlorure de magnésium et 5 mM de chlorure de calcium. Utilisez 10 N 11:8 hydroxyde de sodium :hydroxyde de potassium pour amener le pH à 7,4. Stériliser par filtration ; Ne pas autoclave. Conserver à -20 °C. Décongeler au besoin pour préparer ~200 ml de 1x préparation Robb's par ovocyte.
- Solutions de fixation.
- Option #1 : Préparez la fixation au formaldéhyde/heptane. Préparez le tampon de fixation : 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) plus 150 mM de saccharose. Pour l’utiliser, préparez du frais avec 687,5 μl de tampon de fixation et 312,5 μl de formaldéhyde à 16 % par ovocyte><.
prudence: Portez des gants lorsque vous utilisez des solutions de formaldéhyde dans une hotte. Éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles.
- Option #2 : Préparez la fixation au formaldéhyde/cacodylate. Préparez le mélange Fix : 250 mM de saccharose, 100 mM d’acétate de potassium (pH 7,5), 25 mM d’acétate de sodium (pH 7,0) et 25 mM d’EGTA (pH 8,0). Pour l’utiliser, préparez des produits frais avec 400 μl de Fix Mix, 100 μl de cacodylate de potassium (1 M, pH 7,2) et 500 μl de formaldéhyde à 16 % par préparation d’ovocyte
prudence: Le cacodylate de potassium contient de l’arsenic.
- Préparez PBS/Triton X-100 : 1x PBS plus 1 % ou 0,05 % Triton X-100. Conserver à 4 °C.
- Préparez PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB) : 1x PBS, 0,5 % BSA (p/v) et 0,1 % Tween-20. Peut être conservé à 4 °C pendant une semaine.
2. Collection d’ovocytes de drosophile à un stade avancé
- Comme les ovocytes de drosophile dont la membrane est intacte adhèrent au plastique et au verre, pré-enduire l’intérieur d’un tube de 5 ml et d’une pipette Pasteur par ovocyte avec du PTB.
- Anesthésez toutes les ~100 à 300 mouches levurées avec du dioxyde de carbone et ajoutez-les dans un mélangeur contenant ~100 ml 1x tampon Robb's. Pulsez trois fois (~1 sec chacune). Conservez les ovocytes dans Robb's pendant <20 min pour éviter l'activation.
REMARQUE : Alternativement, les ovocytes peuvent être disséqués à la main sur les femelles. L’avantage de cette méthode est qu’elle nécessite moins de femelles. Cependant, il faut prendre soin de limiter l’exposition au dioxyde de carbone à seulement quelques minutes pour éviter les artefacts associés à l’hypoxie.
- Filtrer à travers de grandes mailles (~1 500 μm) dans un bécher de 250 ml pour éliminer les grosses parties du corps. S'il reste de nombreux abdomens intacts sur le grillage, broyez à nouveau le matériau à l'aide d'un tampon Robb supplémentaire et filtrez à nouveau. Laisser reposer ~2 min, puis aspirer la couche supérieure, en enlevant autant de grosses parties du corps que possible.
- Filtrer à travers de petites mailles (~300 μm) dans un bécher de 250 ml. Rincer les ovocytes restants du premier bécher à l'aide d'une pipette Robb's supplémentaire et d'une pipette Pasteur enrobée. Laisser reposer ~3 min ; Les ovocytes se déposeront. Aspirez tous sauf ~10 ml.
- Versez autant de 10 ml que possible dans un tube de 5 ml enduit. Laisser déposer, retirer le liquide et répéter avec le reste. Rincer les ovocytes restants du bécher à l'aide d'une pipette Robb's supplémentaire et d'une pipette Pasteur enrobée. Laisser reposer dans un tube de 5 ml pendant ~3-5 min.
3. Traitements médicamenteux (facultatif)
- Enduire un deuxième tube de 5 ml de PTB pour chaque préparation d'ovocyte. Ajouter un solvant (témoin) ou un médicament approprié à 1 ml de Robb's pour chaque préparation d'ovocytes (tableau 1).
- Divisez les ovocytes dans un deuxième tube de 5 ml enrobé. Laissez déposer, retirez le liquide et ajoutez 1 ml de solvant Robb's plus dans un tube et 1 ml de médicament Robb's plus dans le deuxième tube. Nuter pendant une durée appropriée pour le traitement médicamenteux (tableau 1). Laisser reposer.
4. Fixation
- Aspirez tout le liquide et ajoutez immédiatement 1 ml de Fix.
- Option #1 : Fixation au formaldéhyde/heptane (tampon de fixation plus 5 % de formaldéhyde).
- Fixez pendant 2,5 min sur un nutator. Ajouter 1 ml d’heptane et le vortex 1 min. Laisser reposer ~1 min.
- Retirez tout le liquide, puis ajoutez 1 ml 1x PBS. Vortex 30 sec. Laisser reposer ~1 min.
- Retirez tout le liquide, puis remplissez le tube avec 1x PBS.
REMARQUE : Les ovocytes peuvent être utilisés immédiatement ou conservés sur le nutateur pendant plusieurs heures à température ambiante.
- Option #2 : Fixation formaldéhyde/cacodylate (Fix Mix plus 8 % de formaldéhyde et 100 mM de cacodylate).
- Fixez pendant 6 min sur un nutator. Laisser reposer 2 min. Retirez le liquide, puis remplissez le tube avec 1x PBS.
REMARQUE : Les ovocytes peuvent être utilisés immédiatement ou conservés sur le nutateur pendant plusieurs heures à température ambiante.
5. Enlever les membranes (« Rouler »)
- À l’aide d’une pipette Pasteur enrobée, ajoutez ~500 à 1 000 ovocytes dans la partie givrée (sablée) d’une lame de verre. Retirez toutes les parties du corps et les matériaux étrangers à l’aide d’une pince. Ne laissez pas les ovocytes se dessécher ; ajoutez 1x PBS si nécessaire.
- Placez une lamelle sur les ovocytes et « roulez » doucement les ovocytes jusqu’à ce que toutes les membranes soient retirées (il est préférable de faire glisser le bord de la lamelle sur les ovocytes). Vérifiez périodiquement les progrès au microscope, en ajoutant plus de PBS 1x si nécessaire. Faites attention car une pression trop importante détruira les ovocytes.