$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ce protocole est un extrait de Perkins et Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Élimination des chorions et des membranes vitellines
REMARQUE : Voir Figure 1 pour les outils nécessaires.
- Séparer les ovocytes à un stade avancé
- Ajouter 1 mL de PBSBTx dans un plat de dissection peu profond. Utilisez un P200 avec un embout enrobé de BSA pour transférer les ovaires fixes (en ~150 μL) dans la boîte peu profonde. Pipetez les ovaires de haut en bas avec la pointe de pipette recouverte de BSA pour déloger les ovocytes matures des ovocytes moins matures.
- Lorsque les ovocytes à un stade avancé sont suffisamment séparés, transférez tout le tissu dans un tube microfuge de 500 μL. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette Pasteur tirée, en laissant environ 150 à 200 μL dans le tube. Répéter la section 1.1 pour les génotypes restants.
- Préparez-vous à rouler
- Pré-mouiller un plat profond avec 200 μL de PBSBTx. Couvrir et réserver. Obtenez 3 lames en verre dépoli et mettez la diapositive #3 de côté. Frottez doucement les régions de verre dépoli des lames #1 et #2 ensemble. Rincez-les à l’eau déminéralisée pour enlever les éclats de verre et séchez-les avec une lingette jetable.
- Enduisez les régions givrées des lames #1 et #2 avec du PBSBTx en ajoutant 50 μL de PBSBTx à une lame et en frottant cette région avec l’autre lame. Retirez le liquide avec une lingette jetable.
- Placez les lames sous un microscope à dissection dans la configuration illustrée à la Figure 2A. Gardez les régions givrées des diapositives #1 et #2 en contact, avec la diapositive #3 soutenant la diapositive #2.
- Roulez les ovocytes ; assurez-vous que le sens du roulement est toujours en ligne droite et jamais un mouvement circulaire.
- Prémouillez une pointe de pipette P200 dans PBSBTx et dispersez les ovocytes dans le tube de microfuge en pipetant de haut en bas. Transférez 50 μL de liquide contenant des ovocytes au centre de la partie en verre dépoli de la lame #1. Soulevez la glissière #2 pour ce faire.
- Abaissez lentement la glissière #2 jusqu’à ce que la tension superficielle du liquide crée un joint entre les deux régions de verre givré. Il devrait y avoir suffisamment de liquide pour couvrir la zone givrée, mais aucun ne devrait s’échapper. Si le liquide déborde, utilisez une pipette Pasteur tirée pour éliminer l’excès de liquide.
- Tenez la glissière inférieure (#1) en place d’une main et utilisez l’autre main pour déplacer la glissière supérieure (#2) d’avant en arrière dans une direction horizontale, en maintenant la glissière #2 à niveau et soutenue sur la diapositive #3. Effectuez sous un microscope pour une visualisation facile des mouvements et de la progression des ovocytes.
REMARQUE : Ce mouvement va générer des frottements et faire « rouler » les ovocytes et faire perdre leur chorion. Une pression minimale doit être utilisée et les mouvements doivent être courts et rapides.
- Après quelques mouvements dans le sens horizontal, modifiez légèrement l’angle de mouvement (Figure 2B). Par incréments multiples, augmentez progressivement cet angle jusqu’à 90° jusqu’à ce que le mouvement de la glissière supérieure soit perpendiculaire à la direction de départ (Figure 2B). Notez que les chorions vides seront visibles dans le liquide et que les ovocytes dépourvus de chorions apparaîtront plus longs et plus minces.
- Répétez les étapes 1.3.3 à 1.3.4 environ 7 à 10 fois jusqu’à ce que la solution devienne légèrement trouble. Arrêtez de rouler lorsque la majorité des ovocytes (75 à 85 %) semblent avoir perdu leurs membranes vitellines.
REMARQUE : Une extrémité pointue distinctive est souvent visible sur les ovocytes dépourvus de membranes vitellines. Les membranes vitellines sont plus difficiles à enlever que les chorions. Une légère pression peut être appliquée sur la glissière supérieure (diapositive #2) pendant le roulement pour obtenir l’élimination des membranes vitellines. Essayer d’enlever les membranes vitellines de tous les ovocytes entraîne souvent la destruction d’autres ovocytes.
- Soulevez doucement la diapositive supérieure (#2), en faisant glisser l’un de ses coins vers le centre de la région givrée de la diapositive inférieure (#1) afin que les ovocytes roulés s’accumulent au centre de la région givrée. Rincez les ovocytes des deux lames avec PBSBTx dans la boîte à puits profond contenant PBSBTx.
- Nettoyez les lames #1 et #2 avec de l’eau ultra-pure, séchez-les avec une lingette jetable et réinitialisez-les. Répétez les étapes 1.3.1 à 1.3.6 jusqu’à ce que tous les ovocytes du même génotype aient été roulés. Cela nécessite généralement 3 à 4 cycles de roulement par génotype.
- Enlever les débris après le roulement
- Ajouter 1 mL de PBSBTx dans un tube conique de 15 mL. Faites tourbillonner le liquide pour enrober les côtés du tube.
- À l’aide d’une pointe de pipette P1000 revêtue de PBSBTx, transférez les ovocytes roulés de la boîte à puits profond dans le tube conique contenant 1 mL de PBSBTx. Ajoutez 2 mL supplémentaires de PBSBTx dans le tube conique contenant les ovocytes.
- Laissez les ovocytes commencer à se déposer vers le bas, puis retirez les 2 mL supérieurs de solution contenant des débris (chorions, vitellines, etc.) avec un P1000 et jetez-les. Si nécessaire, tenez le tube conique contre un fond sombre pour voir les ovocytes opaques pendant qu’ils coulent.
- Ajoutez 2 ml supplémentaires de PBSBTx dans les ovocytes et répétez l’étape 1.4.3. Répétez l’opération 1.4.3. pour un total de 3 tours d’enlèvement de débris.
- À l’aide d’une pointe de pipette P1000 revêtue de PBSBTx, transférez les ovocytes dans le tube microfuge d’origine de 500 μL. 20 à 25 femelles devraient produire environ 50 μL d’ovocytes matures enroulés.
- Répétez la section 4 pour les génotypes restants à l’aide de lames givrées fraîches, d’une boîte à puits profond propre et d’un nouveau tube conique pour chaque génotype.
- Si un stockage est nécessaire, transférez les ovocytes dans 1x PBS avec 0,1 % de TritionX-100 et conservez-les toute la nuit à 4 °C. Le stockage à long terme n’est pas recommandé car la réticulation du formaldéhyde peut être inversée par des détergents non ioniques.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.