Rupture des cuticules : une méthode pour collecter l’hémolymphe des larves de drosophile

Résumé

Source : Reimels, T. A. et Pfleger, C. M. Méthodes pour examiner les glandes lymphatiques et les hémocytes chez les larves de drosophile. J. Vis. Exp. (2016).

L’hémolymphe de la drosophile sert à la fois de sang et de liquide interstitiel, circulant dans tout le corps pendant les stades larvaire et adulte. Cette vidéo décrit un protocole de collecte de l’hémolymphe larvaire afin de quantifier les cellules circulantes.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Reimels et Pfleger, Methods to Examination the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp.(2016).

1. Concentration d’hémocytes circulants

1. Pour obtenir des larves à peu près du même stade de développement pour cet essai, limitez la collecte d’œufs en laissant les femelles pondre pendant une période de temps fixe de 2 à 6 heures.
2. Recueillir les larves dans des puits de dissection remplis de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Pour chaque larve, placez 10 μl 1x PBS dans un tube de microcentrifugation sur de la glace et 10 μl 1x PBS sur un tampon de dissection propre. Placez le tampon de dissection sur une base de stéréomicroscope éclairée.
4. Séchez une larve individuelle en la plaçant sur une lingette en tissu avant de la transférer dans une goutte PBS sur le tampon de dissection.
5. À l’aide d’une paire de pinces, déchirez doucement et retournez soigneusement la cuticule pour libérer l’hémolymphe.
   REMARQUE : Veillez à ne pas gratter ou piquer la cuticule car cela pourrait potentiellement libérer des hémocytes sessiles.
6. À l’aide d’une pipette, prélevez l’hémolymphe du tampon de dissection. Évitez de collecter des débris larvaires tels que le corps adipeux.
7. Ajoutez l’hémolymphe dans un tube de microcentrifugation et mélangez en pipetant de haut en bas.
   REMARQUE : Plusieurs échantillons peuvent être prélevés à la fois et conservés sur de la glace jusqu’à une heure.
8. Facultatif : Mélangez le bleu de trypan avec l’échantillon d’hémolymphe à parts égales pour teindre et exclure les cellules mortes. Comptez les cellules dans les 3 minutes suivant l’ajout de Trypan blue car il est toxique pour les cellules.
9. Mélangez l’échantillon en pipetant de haut en bas avant de charger 10 μl dans une chambre d’hémocytomètre.
10. Si vous utilisez un compteur de cellules automatisé, définissez les paramètres appropriés pour la taille et la circularité des cellules. Par exemple, définissez une taille de cellule minimale de 2 μm, une taille de cellule maximale de 22 μm et une circularité de 75 à 80 % de circularité pour détecter les hémocytes normaux et ronds. Expérimentez avec différents paramètres pour détecter des hémocytes plus grands et en forme de fuseau, tels que les lamellocytes. Vous pouvez également utiliser un hémocytomètre pour compter manuellement les hémocytes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Comprimés PBS	MP Biomédical	2810305
plat de dissection	Corning	Référence 7220-85
Tube de microcentrifugation	Denville	Réf. C2170
Tampon de dissection en silicone, fabriqué à partir du kit Sylgard 184	Krayden (distribué par Fisher)	NC9644388 (numéro de catalogue Fisher)	Fabriqué en boîte de Pétri en mélangeant les composants du kit élastomère Sylgard selon les instructions du fabricant.
Stéréomicroscope	Morrell Instruments (distributeur Nikon)	mna42000, mma36300	Modèles Nikon SMZ1000 et SMZ645
lingette en tissu	VWR	Référence 82003-820
forceps	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72700-DZ
Pipette P200	Eppendorf	3120000054
Compteur de cellules automatisé Countess	Invitrogen	Réf. C10227
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	Invitrogen	Réf. C10283
Hémocytomètre	Hausser Scientific	3200
Teinture bleue trypan	Technologies de la vie	Réf. T10282