Dissection du complexe œil-cerveau à partir de pupes de mouches : une méthode pour isoler le tissu rétinien

Abstract

Source : DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection de la rétine nymphale de la drosophile pour l’immunohistochimie, l’analyse de Western et l’isolement de l’ARN. J. Vis. Exp.(2019).

Cette vidéo décrit comment disséquer et isoler le complexe œil-cerveau des pupes de drosophile. Le protocole présenté démontre la procédure permettant d’obtenir des tissus de haute qualité, compatibles, par exemple, avec l’immunomarquage, ainsi qu’avec d’autres expériences d’expression génique.

Protocol

Ce protocole est un extrait de DeAngelis et Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. Préparation des tissus

1. Mettre en place des croisements de drosophiles (comme décrit précédemment dans Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) ou des souches de drosophile spécifiques à la culture pour obtenir des pupes du génotype souhaité. Pour s’assurer qu’un grand nombre de pupes émergent par coïncidence, établissez ces cultures de mouches en double sur des milieux alimentaires riches en nutriments ou des milieux alimentaires standard généreusement complétés par de la pâte de levure.
2. Maintenir les cultures de drosophiles à 25 °C. Pour les croisements utilisant le système UAS-GAL4, GMR-GAL4 est un pilote idéal exprimé dans les cellules du disque oculaire larvaire postérieurement au sillon morphogénétique et tout au long du développement de la nymphe. Le croisement UAS-lacZ X GMR-GAL4 constitue un croisement de contrôle idéal car il stimule l’expression de la protéine β-galactosidase, non endogène et inerte.
3. À l’aide de l’extrémité d’une attelle de bambou de 6 po qui a été mouillée avec de l’eau distillée, soulever doucement les pré-pupes blanches (Figure 1B) du côté des flacons de culture sains (Figure 1A) et les placer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (Figure 1C).
4. Placez les tubes dans une boîte en plastique avec un petit morceau de tissu trempé dans de l’eau distillée pour maintenir la chambre à un taux d’humidité suffisant pour protéger les pupes de la dessiccation (Figure 1D). Incuber les pupes à 25 °C jusqu’à la dissection.
5. Utilisez une attelle de bambou sèche de 6 pouces pour pousser doucement les pupes hors du tube de microcentrifugation et sur un plat de dissection noir. Posez un nouveau morceau de ruban adhésif double face sur le plat de dissection en l’éloignant des nymphes.
6. À l’aide d’une paire de pinces, placez soigneusement les pupes côté dorsal vers le haut (c’est-à-dire, opercules vers le haut, Figure 1B) sur le ruban (Figure 2A). Assurez-vous que les pupes adhèrent bien au ruban.
   REMARQUE : L’humidité sur la boîte nymphale inhibera l’adhérence sûre au ruban, auquel cas, laissez les pupes sécher à l’air libre avant de les placer sur le ruban adhésif double face.

2. Dissection des complexes œil-cerveau

1. Utilisez une pince pour retirer l’opercule de chaque chrysalide (Figure 2C).
2. Utilisez des ciseaux de microdissection pour trancher ou ouvrir la boîte de nymphe de chaque nymphe. Ouvrez le rabat de la nymphe pour révéler la tête, le thorax et le segment abdominal antérieur, en fixant les bords de la nymphe au ruban adhésif double face (Figure 2C).
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de révéler entièrement les nymphes.
3. Percez l’abdomen de chaque chrysalide à l’aide d’une pince tranchante, pour saisir l’animal, et retirez-le de sa nymphe (Figure 2C).
4. Placez les pupes sur la boîte de dissection noire, à l’écart du ruban adhésif, et recouvrez d’environ 400 μL de solution tamponnée au phosphate glacée (PBS, pH 7,4).
5. Saisissez chaque chrysalide par l’abdomen à l’aide d’une pince et, à l’aide de ciseaux de microdissection, faites une coupe transversale nette sur tout le thorax, coupant la chrysalide en deux (Figure 2D).
6. Retirer le reste postérieur de chaque carcasse du PBS et le mettre de côté sur le plat de dissection (ne pas jeter, voir l’étape 3.2.1).
7. À l’aide de deux paires de pinces fines, ouvrez le thorax et la tête de chaque chrysalide pour révéler le complexe œil-cerveau (Figure 2E). Pour ce faire, saisissez les bords coupés de l’épithélium du thorax et déchirez progressivement pour ouvrir le thorax puis la capsule cintrenière, exposant le complexe œil-cerveau et le tissu adipeux environnant.
8. Sans saisir le tissu, utilisez une pince pour guider le complexe œil-cerveau loin des restes de la capsule céphalique ou prélevez le complexe œil-cerveau de la capsule céphalique déchirée.
   REMARQUE : Le complexe œil-cerveau est en forme d’haltère, blanc cassé et plus translucide que la graisse de couleur crème environnante (Figure 2B,E).
9. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement la plupart de la graisse associée aux complexes œil-cerveau sans toucher le tissu oculaire.

3. Traitement des tissus pour l’immunofluorescence

1. Disséquez au moins 6 à 10 pupes comme décrit (étapes 2.1-2.9).
   REMARQUE : Trois à quatre répétitions indépendantes de chaque dissection ont tendance à fournir suffisamment de données pour tester une hypothèse.
2. Lavage et fixation
   1. Coupez la pointe d’une pointe de pipette P20 ou P100 avec une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de la pointe à ~1 mm de rayon et lubrifiez en pipetant un mélange de PBS et de graisse de haut en bas. Ce gras peut être obtenu à partir des restes de carcasse retirés à l’étape 2.6.
   2. Transférez les complexes œil-cerveau dans ~400 μL de PBS dans un plat en verre à 9 puits, sur de la glace. Utilisez l’embout lubrifié et une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 pour transférer.
      REMARQUE : Les complexes œil-cerveau adhèrent aux pointes non lubrifiées pendant le pipetage et sont endommagés ou perdus.
   3. Retirez la graisse restante associée au tissu oculaire en pipetant le PBS de haut en bas pour faire tourbillonner doucement les complexes œil-cerveau. Au cours de cette étape de lavage et de toutes les suivantes, ne pipetez pas directement les complexes œil-cerveau de haut en bas, car cela endommagerait les tissus oculaires fragiles.
   4. Transférez les complexes œil-cerveau dans un volume minimal (<20 μL) de PBS dans au moins 250 μL de fixateur. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber pendant 35 min, sur ice.
      REMARQUE : La même pointe lubrifiée préparée à l’étape 3.1.1 peut être utilisée pour ce transfert.
   5. Avec la même pointe de pipette, transférez les complexes œil-cerveau dans un puits contenant ~400 μL de PBS. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas et incuber pendant 5 à 10 min sur de la glace, pour laver. Répétez l’étape de lavage au moins deux fois.
      REMARQUE : Les complexes œil-cerveau peuvent être maintenus pendant plusieurs heures lors du lavage final du PBS, sur de la glace ou à 4 °C, avant de passer à l’étape 3.3.1.
3. Coloration des anticorps
   1. Pour bloquer le tissu avant l’exposition aux solutions d’anticorps, transférez les complexes œil-cerveau à ~400 μL de PBT. Utilisez l’embout lubrifié et une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 pour le transfert. Incuber pendant 10 à 60 min, sur glace.
   2. Préparez la solution d’anticorps primaires en diluant les anticorps appropriés dans du PBT. Étant donné que les complexes œil-cerveau sont incubés dans des aliquotes de 10 μL de solution d’anticorps, le volume préparé sera une répétition de 10.
   3. Aliquote 10 μL de solution d’anticorps dans un puits propre d’un plateau de micropuits de 72 puits.
   4. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P10 avec une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de la pointe à ~0,5 mm de rayon et lubrifiez en pipetant le PBT de haut en bas.
   5. Ne transférez pas plus de 5 complexes œil-cerveau, dans un volume de <3 μL de PBS, dans chaque puits de 10 μL de solution d’anticorps à l’aide d’une micropipette à déplacement d’air P10 et de l’embout lubrifié.
   6. Homogénéisez la solution d’anticorps en la pipetant de haut en bas. Ne pipetez pas les complexes œil-cerveau de haut en bas car cela endommagerait les tissus.
   7. Pour minimiser l’évaporation de la solution d’anticorps, placez un petit morceau de tissu trempé dans de l’eau distillée dans le plateau du micropuits et fermez le plateau (p. ex., avec le couvercle fourni). Incuber toute la nuit à 4 °C.
   8. Transférez les complexes œil-cerveau du plateau à micropuits dans ~400 μL de PBT dans un plat en verre à 9 puits, pour laver. À l’aide d’une micropipette à déplacement d’air P10 et d’un embout lubrifié au PBT (préparer comme décrit à l’étape 3.3.4). Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur de la glace.
   9. Répétez l’étape de lavage au moins deux fois. À l’aide d’une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 et d’une pointe lubrifiée au PBT, vous pouvez transférer les complexes œil-cerveau entre les solutions de lavage.
   10. Préparez la solution d’anticorps secondaires en diluant au besoin des anticorps secondaires marqués au fluorophore appropriés dans du PBT. 100 μL de solution d’anticorps secondaires suffisent par lot de 6 à 10 nymphes. Aliquote la solution secondaire d’anticorps dans une boîte de dissection en verre à 9 puits.
   11. Transférez les complexes œil-cerveau dans une solution d’anticorps secondaire. Utilisez une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée au PBT pour le transfert.
   12. Incuber les complexes œil-cerveau dans une solution secondaire d’anticorps pendant 1 à 2 h à température ambiante ou 3 à 5 h à 4 °C. Pour éviter le blanchiment des fluorophores par la lumière, recouvrez la préparation de foil.
       REMARQUE : La durée optimale d’incubation dans une solution d’anticorps secondaires peut varier selon les anticorps primaires et secondaires utilisés.
   13. Transférez les complexes œil-cerveau dans ~400 μL de PBT dans un plat en verre à 9 puits, pour laver. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur de la glace. Cette étape de lavage doit être répétée au moins deux fois.
4. Fixation secondaire
   1. Pour une fixation secondaire, transférez les complexes œil-cerveau dans au moins 200 μL de fixateur et incubez pendant 20 min à température ambiante ou 35 min à 4 °C
      REMARQUE : La fixation secondaire rigidifie le tissu oculaire, ce qui facilite le montage (étape 3.5).
   2. À l’aide d’une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 et d’un embout lubrifié au PBT, transférez les complexes œil-cerveau dans ~400 μL de PBT dans un plat en verre à 9 puits, sur de la glace, pour laver pendant 5 min.
   3. Répétez l’étape de lavage au moins une fois.
   4. À l’aide d’une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 et d’un embout lubrifié au PBT, transférez les complexes œil-cerveau dans ~400 μL de PBS dans un plat en verre à 9 puits, sur de la glace, pour rincer pendant 1 à 2 min. Gardez le tissu en mouvement en pipetant le PBS, mais pas le tissu, de haut en bas pour empêcher les complexes œil-cerveau de se déposer et d’adhérer au plat en verre pendant le rinçage du PBS.
5. montage
   1. Transférez les complexes œil-cerveau dans ~200 μL de milieu de montage. Utilisez une micropipette à déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée au PBT pour transférer les complexes œil-cerveau. Laisser le tissu s’équilibrer dans le milieu de montage pendant 1 à 2 h.
   2. Placez une goutte de 5 à 8 μL de support de montage frais sur une lame de microscope propre.
   3. Coupez une pointe P10 avec une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de la pointe à ~0,5 mm de rayon et utilisez-la ainsi qu’une micropipette à déplacement d’air P10 pour transférer les complexes œil-cerveau dans 5 à 8 μL de support de montage dans la goutte de support de montage sur la lame.
   4. Utilisez deux aiguilles en tungstène pour séparer les yeux des lobes optiques. Fixez un complexe œil-cerveau à la lame à l’aide d’une aiguille de tungstène robuste et coupez chaque œil de son lobe optique associé à l’aide d’une fine aiguille de tungstène (Figure 2F).
   5. Utilisez la fine aiguille de tungstène pour manœuvrer chaque œil vers la surface de la lame de microscope, la surface basale de chaque œil étant adjacente à la lame. Abaissez doucement une lamelle propre sur le mouchoir et fixez-la avec du vernis à ongles.
      REMARQUE : Disposer les yeux sur la lame de manière à ce qu’ils soient proches les uns des autres ou alignés facilitera la microscopie ultérieure.
   6. Imagez les rétines à l’aide de la microscopie fluorescente ou confocale.
      REMARQUE : Les lames doivent être stockées à 4 °C si elles ne sont pas imagées immédiatement.

Results

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attelles en bambou, 6"	Ted Pella Inc	116
Plat de dissection noir			Boîte de Pétri en verre remplie jusqu’au bord de SYLG170 ou de SYLG184 (colorée en noir avec de la poudre de charbon de bois finement moulue). Laisser à température ambiante pendant 24-48 h pour polymériser.
Porte-lame	Outils scientifiques fins	Référence 10053
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Ruban adhésif double face	3m	665
Drosophile et milieux alimentaires, riches en nutriments			7,5 % de saccharose, 15 % de glucose, 2,5 % d’agar, 20 % de levure de bière, 5 % de peptone, 0,125 % de MgSO4.7H2O, 0,125 % de CaCl2.2H20
Drosophile & milieux alimentaires, standard			Recette de semoule de maïs centrale de bouillon de drosophile de Bloomington. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Solution fixatrice			4 % de formadehyde dans PBS, pH 7,4.
forceps	Outils scientifiques fins	Référence 91150-20	Les pinces doivent être affûtées fréquemment.
Formaldéhyde	Thermo Scientific	Référence 28908
Plats en verre à 9 puits	Corning	Référence 7220-85	Aussi connu sous le nom de plats à 9 puits
Lamelles en verre (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Lames de microscope en verre (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	Tél. : 12-550-413
Boîte de Pétri en verre	Corning	3160-100BO
glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516
Tubes microcentrigues	Axygen	MCT-175-C
Ciseaux de microdissection	Outils scientifiques fins	Référence 15000-03
Plateaux à micropuits (72 puits de 10 μL)	Nunc	438733
Supports de montage			0,5 % de N-propylgallate et 80 % de glycérol dans le PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	Réf. P3130
PBS (solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4)	Sigma-Aldrich	Réf. P5368	Préparer selon les instructions du fabricant
Pbt			0,15 % de TritonX et 0,5 % d’albumine sérique bovine dans le PBS, pH 7,4
Porte-goupille	Outils scientifiques fins	Référence 26016-12
Anticorps primaire : chèvre anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	Pour le western blot. Utilisé à 1:3000
Anticorps primaire : Dcp-1 anti-clivé de lapin	Signalisation cellulaire	9578S	Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100
Anticorps primaire : anti-DEcad chez le rat	Etudes développementales Hybridoma Bank	DACM2	Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:20
Anticorps primaire : anti-DEcad chez le rat	DOI : 10.1006/dbio.1994.1287	DAC1	Don de Tadashi Uemura. Utilisé à 1:100.
Lames de scalpel	Outils scientifiques fins	Référence 10050	Cassez un petit morceau de la lame du scapel et fixez-le dans le porte-lame.
Anticorps secondaire : IgG anti-rat d’âne conjugué à 488 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 712-545-153	Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:200
Anticorps secondaire : IgG anti-lapin de chèvre conjuguée cy3 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Référence : 111-165-144	Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100
Anticorps secondaire : IgG anti-rat de chèvre conjuguées à HRP (H+L)	Technologie de signalisation cellulaire	N° 7077	Pour le western blot. Utilisé à 1:3000
Anticorps secondaires : IgG de lapin anti-chèvre conjuguées à HRP (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Référence 305-035-003	Pour le western blot. Utilisé à 1:3000
Microscope stéréo de dissection (M60 ou M80)	Microsystèmes Leica		ou microscope similaire
Sylgard (noir)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Couleur noire avec poudre de charbon finement moulue
Mouchoir en papier : Kimwipes	KIMTECH	Référence 34120
TritonX	Sigma-Aldrich	Réf. T8787
Aiguille en tungstène, fine	Outils scientifiques fins	Référence 10130-10	Insérer dans le porte-goupille
Aiguille en tungstène, robuste	Outils scientifiques fins	Référence 10130-20	Insérer dans le porte-goupille
Pâte de levure	(supermarché local)		Environ 2 cuillères à soupe de levure Fleischmann's ActiveDry (ou similaire) dissoute dans ~20 mL de H2O distillé