drosophile Dissection musculaire de vol indirect (IFM) de la chrysalide tardive : une méthode de prélèvement de tissus à haut débit

Résumé

Source : Kao, S. Y., et al. Dissection des muscles de vol de Drosophila melanogaster pour les approches omiques. J. Vis. Exp. (2019).

Les muscles de vol de la drosophile sont utilisés comme système modèle pour le développement musculaire et la physiologie. Cette vidéo décrit la musculature de vol des adultes et met en évidence un protocole pour disséquer les muscles de vol indirect en développement qui conviennent au séquençage de l’ARN des nymphes.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Dissection IFM après 48 h APF

1. Assemblez l’équipement nécessaire, y compris deux pinces de qualité biologique #5, des ciseaux fins, des lames de microscope en verre standard, du ruban adhésif double, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les applications d’ARN) un réactif d’isolement (voir le tableau des matériaux). Réfrigérez les 1x tubes PBS et microcentrifugeuses sur de la glace.
2. À l’aide d’un pinceau légèrement mouillé, transférez les pupes étagées sur une bande de ruban adhésif double face montée sur une lame de microscope (Figure 1A). Placez les pupes en ligne, orientées dans la même orientation (ventrale vers le bas et antérieure vers le bas de la lame).
   REMARQUE : Attention à ne pas utiliser trop d’eau sur le pinceau ou le filtre, sinon les pupes ne colleront pas bien. Si les pupes ne collent pas, séchez-les en les transférant d’abord sur un filtre sec ou du papier de soie. Montez autant de pupes que possible dans une fenêtre de temps de 30 minutes, idéalement ~10 nymphes.
3. Retirez la chrysalide de la nymphe. À l’aide d’une pince, séparez et ouvrez l’enveloppe nymphale au-dessus des spiracles antérieurs (Figure 1B).
4. Faites glisser doucement une paire de pinces dorsalement vers l'arrière, en coupant l'enveloppe nymphale au fur et à mesure que la pince se déplace (Figure 1B'). Veillez à ne pas rompre la chrysalide sous-jacente. Libérez la chrysalide de l’étui ouvert et transférez-la immédiatement dans une goutte de 1x PBS sur une deuxième lame de microscope (Figure 1B »,C).
5. Répétez les étapes 1.3 et 1.4 pour toutes les pupes de la ligne, puis mettez la glissière de ruban adhésif de côté.
6. À l'aide des ciseaux fins, coupez l'abdomen de la chrysalide loin du thorax et poussez-le en un tas séparé (Figure 1D,D'). Répétez l’opération pour les pupes restantes.
   REMARQUE : Commencez à chronométrer la durée de la dissection avec l’étape 1.6, dès que l’intégrité de la nymphe est perturbée. Disséquez autant de mouches que possible en 20 à 30 minutes pour prévenir la mort cellulaire et les modifications transcriptomiques et protéomiques associées. Lors de la dissection de 1 d adultes ou de >90 h de nymphes, il est souvent pratique pour les étapes ultérieures d’enlever en plus la tête avec les ciseaux fins.
7. À l’aide d’un papier de soie, retirez la majorité des 1x PBS (généralement troubles avec de la graisse en suspension) ainsi que le tas d’abdomens (Figure 1E). Ajoutez une goutte de 1x PBS frais et réfrigéré aux thorax restants.
8. Utilisez les ciseaux pour couper le thorax en deux (Figure 1F,F') en coupant de la tête vers le bas de l'axe longitudinal du corps en un seul mouvement. Alternativement, si la tête a été retirée, insérez d’abord les ciseaux à l’endroit où la tête était attachée et coupez la moitié supérieure du thorax longitudinalement entre les IFM. Ensuite, coupez la face ventrale du thorax avec une deuxième coupe dans la même orientation.
9. Répétez les étapes 1.7 et 1.8 pour toutes les pupes à disséquer, générant un tas d’hémisections thoraciques près du centre de la lame. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de PBS réfrigéré sur la lame pour que les hémisections ne se dessèchent pas.
   REMARQUE : Après 48 h d’APF, les IFM sont suffisamment grands pour être visibles par un microscope de dissection standard pour l’œil exercé. À ce stade du protocole, les muscles munis d’un marqueur fluorescent peuvent être déplacés vers une lunette de dissection fluorescente pour faciliter l’identification de l’IFM ou à des fins d’entraînement, mais ce n’est pas nécessaire.
10. Disséquez les IFM du thorax. Isolez l’un des hémisections à l’aide de la pince #5 (Figure 1G,H). Insérez délicatement les pointes d'une pince au-dessus et au-dessous du milieu des IFM (Figure 1G',H'). Tout en maintenant la première pince immobile, utilisez des ciseaux fins pour couper une extrémité de l’IFM loin de la cuticule et des tendons. Ensuite, coupez l'autre extrémité de l'IFM libre de la cuticule (Figure 1G'',H'').
    REMARQUE : En fonction de l’orientation du thorax après la première coupe IFM, il est utile de faire pivoter le thorax de 180° afin que la deuxième coupe IFM soit plus facile à réaliser.
11. Retirez le faisceau IFM du thorax à l'aide d'une pince (Figure 1G''',H'''), en le transférant sur le bord de la bulle PBS pour utiliser la tension de l'eau pour le maintenir en place (Figure 1I). Poussez la carcasse du côté opposé de la glissière. Répétez l’opération pour les hémisections thoraciques restantes, générant une collection d’IFM disséqués.
    REMARQUE : Si les IFM ne restent pas en tas bien rangé, retirez une partie du 1x PBS avec un mouchoir. Veillez à ne pas laisser tout le PBS s’évaporer et assurez-vous que les IFM et les hémithorax disséqués restent recouverts par un tampon.
12. Après avoir disséqué tous les IFM, effectuez rapidement un contrôle qualité sur le muscle disséqué. À l'aide de la pince #5, retirez tous les fragments de muscle de saut ou de cuticule qui auraient pu se retrouver dans l'échantillon (Figure 1J-K'').
    REMARQUE : Le muscle de saut semble différent de l’IFM. Si l’on dissèque un muscle marqué Mef2-Gal4 sous fluorescence, le muscle de saut a une fluorescence plus faible et une forme et une texture différentes. Sous une lumière normale, il apparaît presque translucide tandis que les IFM sont d'un jaune laiteux opaque (Figure 1J-J'',K).
13. À l’aide de la tension de l’eau, capturez (mais n’écrasez pas) les IFM disséqués entre une paire de pinces (Figure 1L). Transférez les IFM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pré-rempli de 250 μL de PBS 1x réfrigéré (Figure 1M). Passez immédiatement à la section 2.
    REMARQUE : Lorsque les pointes des pinces sont rapprochées les unes des autres et retirées d’une solution tampon, la tension de l’eau provoque la capture d’une bulle de tampon entre les pointes des pinces. Si des IFM sont également présents dans cette bulle, ils peuvent être retirés de la solution et facilement transférés dans un autre récipient rempli de tampon. Il est important de presser la pince pour rapprocher les pointes les unes des autres sans se toucher, afin d’éviter de faire macérer le tissu capturé dans la bulle tampon.

2. Granuler et conserver l’échantillon IFM

1. Granulez les IFM en centrifugeant le tube de microcentrifugation de 1,5 mL pendant 3 à 5 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table (Figure 2A,B).
2. Retirez le tampon à l’aide d’une pointe de pipette (Figure 2C).
3. Pour les applications d’ARN, remettre en suspension la pastille IFM dans 50 à 100 μL du tampon d’isolement d’ARN souhaité (voir le tableau des matériaux, Figure 2D). Sinon, passez à l’étape 2.4.
   REMARQUE : Les IFM peuvent être congelés à sec après l’étape 2.2 pour les préparations de spectrométrie de masse ou l’isolement de l’ARN avec des kits commerciaux (voir résultats représentatifs). Pour les applications d’ARN, de meilleurs résultats sont obtenus en remettant immédiatement en suspension et en congelant la pastille IFM dans un tampon d’isolement.
4. Congeler l’échantillon sur de la glace sèche ou la congélation instantanée dans de l’azote liquide (Figure 2E). Conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour les étapes suivantes de la préparation de l’échantillon pour l’analyse en aval.
   REMARQUE : Après cryoconservation, les échantillons peuvent être stockés pendant plusieurs mois avant d’être traités pour une investigation en aval.

Résultats

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Figure supplémentaire...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture de 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Plats greiner, 60 mm x 15 mM, ventilés
Appareil photo de téléphone portable, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	Utilisé pour les photos qui ne sont pas prises au microscope
Ruban adhésif double	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Ruban adhésif double face, disponible chez la plupart des manutentionnaires de fournitures de bureau
Pince Dumont #5	Outils scientifiques fins	Référence 11252-20	Pince inox à pointe droite de 11 cm, qualité biologie avec pointe de 0,05 mm x 0,02 mm
Caméra microscope à dissection fluorescente, caméra Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Logiciel de microscope de dissection fluorescent, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscope à dissection fluorescent, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Mouche : Bru1[M2]			Mouches ; Ce document
Mouche : Bru1[M3]			Mouches ; Ce document
Mouche : Mef2-GAL4	Centre boursier de Bloomington	BDSC :27390	Mouches
Mouche : salm[1]	Centre boursier de Bloomington	Référence 3274	Mouches
Mouche : salm[FRT]			Mouches ; voir Spletter et al., Elife, 2018
Voler : UAS-Bru1IR	Centre de recherche sur la drosophile de Vienne	GD41568	Mouche en épingle à cheveux ARNi
Voler : UAS-GFP ::Gma	Centre boursier de Bloomington	BDSC :31776	Mouches
Voler : UAS-mCD8a ::GFP	Centre boursier de Bloomington	BDSC :5130	Mouches
Mouche : w[1118]	Centre boursier de Bloomington	Référence 3605	Mouches
Mouche : weeP26			Mouches ; voir Clyne et al., Genetics, 2003
Réactif de détection GFP, GFP-Booster	ChromoTek	Référence : GBA488-100
glycogène	Invitrogen	Référence 10814-010
Logiciel de traitement d’image, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Méthode 1 (isolement de l’ARN) : TRIzol	Technologies de la vie	15596018	Solution monophasique d’isothiocyanate de guanidinium et de phénol
Méthode 2 (isolement de l’ARN) : Méthode 1 + Kit sans ADN TURBO	Invitrogen	AM1907	Isolement du TRIzol suivi d’un traitement avec un kit pour éliminer l’ADN
Méthode 3 (isolement de l’ARN) : Kit Direct-zol RNA Miniprep Plus	Recherche Zymo	Années R2070	Isolement de l’ARN dans TRIzol, mais sur des colonnes commerciales au lieu d’utiliser la séparation de phase. Traitement DNase recommandé effectué avec Monarch Dnase I dans le tampon de réaction Monarch DNase I.
Méthode 4 (isolement de l’ARN) : RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Référence 74134	Nous avons utilisé le traitement DNase fourni. Les granulés IFM ont été homogénéisés dans un tampon RTL comme suggéré pour les tissus animaux.
Méthode 5 (isolement de l’ARN) : ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Référence Z6110	Nous avons appliqué le protocole de « purification de l'ARN des tissus fibreux ».
Méthode 6 (isolement de l’ARN) : Monarch Total RNA Miniprep Kit	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	T2010G	Nous avons appliqué le protocole pour les tissus/leucocytes et lysé dans 300 μL de réactif de protection ARN.
Tubes de microcentrifugation	Thermo Fisher	AM12400	Tubes Microfuge sans RNase, 1,5 mL
Lames de microscope	Thermo Fisher	12342108	Glissières standard, non chargées, 1 mm
pinceau	Marabu	Référence 1910000000	Marabu Fino Round No. 0, ou pinceau similaire de n’importe quelle fourniture artistique
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
Tampon PBS (1x)	Sigma-Aldrich	Réf. P4417	Pastilles salines tamponnées au phosphate pour solutions de 1 L, pH 7,4
Pointes de pipette PFA PureTip	Scientifique élémentaire	ES-7000-0101	Substitut facultatif des pointes de pipette standard pour réduire les pertes d’échantillons ; 100 ml, orifice de 0,8 mm
Pointes de pipette	Sigma-Aldrich	Réf. P5161	Pointes de pipette universelles de 200 mL
Concentration d’ARN Approche 1 & Traces d’intégrité de l’ARN, Bioanalyseur	Agilent Technologies	G2939BA
Concentration d’ARN Approche 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
Approche de concentration d’ARN 3, fluorimètre Qubit 4	Invitrogen	Question n°33238
RNase A	Promega	A7937
Eau sans RNase, pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Le DEPC traite l’eau pendant la nuit, puis l’autoclave, pour éliminer toute la RNase.
Kit RT #1 : Kit de transcriptase inverse Super Script III	Invitrogen	Référence 18080-044	Kit de transcription inverse
Kit RT #2 : LunaScript	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	E3010S	Kit de transcription inverse
Kit RT #3 : Kit de transcription inverse QuantiNova	Qiagen	Référence 205410	Kit de transcription inverse
Logiciel statistique : GraphPad Prism	Prisme GraphPad		www.graphpad.com
Logiciel statistique : Microscoft Excel	Microsoft		Acheté dans le cadre de l’offre groupée : Office Famille et Étudiant 2019
Centrifugeuse de table	Eppendorf	5405000760	Centrifugeuse Eppendorf 5425 ou équivalent
Mouchoir en papier/ Lingettes Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Lingettes en tissu standard
Pipette de transfert	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipette en plastique
Ciseaux à ressort Vannas	Outils scientifiques fins	Référence 15000-00	Tranchant de 3 mm, diamètre de la pointe 0,05 mm, longueur 8 cm
Papier Whatman	Sigma-Aldrich	Référence 1004-070	Cercles en papier filtre, grade 4, 70 mm