drosophile Dissection musculaire de vol indirect (IFM) de la chrysalide tardive : une méthode de prélèvement de tissus à haut débit

Résumé

Source : Kao, S. Y., et al. Dissection des muscles de vol de Drosophila melanogaster pour les approches omiques. J. Vis. Exp. (2019).

Les muscles de vol de la drosophile sont utilisés comme système modèle pour le développement musculaire et la physiologie. Cette vidéo décrit la musculature de vol des adultes et met en évidence un protocole pour disséquer les muscles de vol indirect en développement qui conviennent au séquençage de l’ARN des nymphes.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Dissection IFM après 48 h APF

1. Assemblez l’équipement nécessaire, y compris deux pinces de qualité biologique #5, des ciseaux fins, des lames de microscope en verre standard, du ruban adhésif double, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les applications d’ARN) un réactif d’isolement (voir le tableau des matériaux). Réfrigérez les 1x tubes PBS et microcentrifugeuses sur de la glace.
2. À l’aide d’un pinceau légèrem....

Résultats

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Figure supplémentaire.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture de 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Plats greiner, 60 mm x 15 mM, ventilés
Appareil photo de téléphone portable, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	Utilisé pour les photos qui ne sont pas prises au microscope
Ruban adhésif double	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Ruban adhésif double face, disponible chez la plupart des manutentionnaires de fournitures de bureau
Pince Dumont #5	Outils scientifiques fins	Référence 11252-20	Pince inox à pointe droite de 11 cm, qualité biologie avec pointe de 0,05 mm x 0,02 mm
Caméra microscope à dissection fluorescente, caméra Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Logiciel de microscope de dissection fluorescent, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscope à dissection fluorescent, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Mouche : Bru1[M2]			Mouches ; Ce document
Mouche : Bru1[M3]			Mouches ; Ce document
Mouche : Mef2-GAL4	Centre boursier de Bloomington	BDSC :27390	Mouches
Mouche : salm[1]	Centre boursier de Bloomington	Référence 3274	Mouches
Mouche : salm[FRT]			Mouches ; voir Spletter et al., Elife, 2018
Voler : UAS-Bru1IR	Centre de recherche sur la drosophile de Vienne	GD41568	Mouche en épingle à cheveux ARNi
Voler : UAS-GFP ::Gma	Centre boursier de Bloomington	BDSC :31776	Mouches
Voler : UAS-mCD8a ::GFP	Centre boursier de Bloomington	BDSC :5130	Mouches
Mouche : w[1118]	Centre boursier de Bloomington	Référence 3605	Mouches
Mouche : weeP26			Mouches ; voir Clyne et al., Genetics, 2003
Réactif de détection GFP, GFP-Booster	ChromoTek	Référence : GBA488-100
glycogène	Invitrogen	Référence 10814-010
Logiciel de traitement d’image, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Méthode 1 (isolement de l’ARN) : TRIzol	Technologies de la vie	15596018	Solution monophasique d’isothiocyanate de guanidinium et de phénol
Méthode 2 (isolement de l’ARN) : Méthode 1 + Kit sans ADN TURBO	Invitrogen	AM1907	Isolement du TRIzol suivi d’un traitement avec un kit pour éliminer l’ADN
Méthode 3 (isolement de l’ARN) : Kit Direct-zol RNA Miniprep Plus	Recherche Zymo	Années R2070	Isolement de l’ARN dans TRIzol, mais sur des colonnes commerciales au lieu d’utiliser la séparation de phase. Traitement DNase recommandé effectué avec Monarch Dnase I dans le tampon de réaction Monarch DNase I.
Méthode 4 (isolement de l’ARN) : RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Référence 74134	Nous avons utilisé le traitement DNase fourni. Les granulés IFM ont été homogénéisés dans un tampon RTL comme suggéré pour les tissus animaux.
Méthode 5 (isolement de l’ARN) : ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Référence Z6110	Nous avons appliqué le protocole de « purification de l'ARN des tissus fibreux ».
Méthode 6 (isolement de l’ARN) : Monarch Total RNA Miniprep Kit	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	T2010G	Nous avons appliqué le protocole pour les tissus/leucocytes et lysé dans 300 μL de réactif de protection ARN.
Tubes de microcentrifugation	Thermo Fisher	AM12400	Tubes Microfuge sans RNase, 1,5 mL
Lames de microscope	Thermo Fisher	12342108	Glissières standard, non chargées, 1 mm
pinceau	Marabu	Référence 1910000000	Marabu Fino Round No. 0, ou pinceau similaire de n’importe quelle fourniture artistique
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
Tampon PBS (1x)	Sigma-Aldrich	Réf. P4417	Pastilles salines tamponnées au phosphate pour solutions de 1 L, pH 7,4
Pointes de pipette PFA PureTip	Scientifique élémentaire	ES-7000-0101	Substitut facultatif des pointes de pipette standard pour réduire les pertes d’échantillons ; 100 ml, orifice de 0,8 mm
Pointes de pipette	Sigma-Aldrich	Réf. P5161	Pointes de pipette universelles de 200 mL
Concentration d’ARN Approche 1 & Traces d’intégrité de l’ARN, Bioanalyseur	Agilent Technologies	G2939BA
Concentration d’ARN Approche 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
Approche de concentration d’ARN 3, fluorimètre Qubit 4	Invitrogen	Question n°33238
RNase A	Promega	A7937
Eau sans RNase, pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Le DEPC traite l’eau pendant la nuit, puis l’autoclave, pour éliminer toute la RNase.
Kit RT #1 : Kit de transcriptase inverse Super Script III	Invitrogen	Référence 18080-044	Kit de transcription inverse
Kit RT #2 : LunaScript	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	E3010S	Kit de transcription inverse
Kit RT #3 : Kit de transcription inverse QuantiNova	Qiagen	Référence 205410	Kit de transcription inverse
Logiciel statistique : GraphPad Prism	Prisme GraphPad		www.graphpad.com
Logiciel statistique : Microscoft Excel	Microsoft		Acheté dans le cadre de l’offre groupée : Office Famille et Étudiant 2019
Centrifugeuse de table	Eppendorf	5405000760	Centrifugeuse Eppendorf 5425 ou équivalent
Mouchoir en papier/ Lingettes Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Lingettes en tissu standard
Pipette de transfert	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipette en plastique
Ciseaux à ressort Vannas	Outils scientifiques fins	Référence 15000-00	Tranchant de 3 mm, diamètre de la pointe 0,05 mm, longueur 8 cm
Papier Whatman	Sigma-Aldrich	Référence 1004-070	Cercles en papier filtre, grade 4, 70 mm