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Ce protocole est un extrait de Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).
1. Imagerie calcique in vivo
- Utilisez un microscope multiphotonique équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion dans l’eau (voir Tableau des matériaux), installé sur une table isolée des vibrations. Pour la visualisation d’indicateurs calciques basés sur la GFP, réglez le laser sur une longueur d’onde d’excitation de 920 nm et installez un filtre passe-bande GFP.
- À l’aide du bouton de réglage Z grossier, balayez l’axe Z du cerveau et localisez la région cérébrale d’intérêt. Utilisez la fonction de recadrage pour concentrer la numérisation uniquement sur cette zone afin de minimiser le temps de numérisation et pour faire pivoter la vue de numérisation de sorte que la partie antérieure de la tête soit tournée vers le bas.
- Ajustez la taille de l’image à 512 x 512 px, la vitesse de balayage à > 4 Hz et la région de balayage (dans la dimension Y) de manière à ce que les neurones d’intérêt soient couverts.
2. Visualisation des transitoires calciques évoqués par l’odeur grâce au conditionnement olfactif
- Utilisez un système de diffusion d’odeurs qui peut délivrer plusieurs stimuli olfactifs de manière temporellement précise.
- Utilisez un ordinateur supplémentaire pour contrôler l’appareil et pour communiquer avec le logiciel du microscope imageur afin de coordonner les stimulations olfactives avec la capture d’images pendant les expériences.
- Lancez un progiciel de macros préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de diffusion des odeurs (par exemple, un progiciel de macros VBA installé dans le logiciel de contrôle du microscope, voir le Tableau des matériaux) qui répond à un déclencheur d’entrée externe fourni par le lancement d’un protocole de diffusion des odeurs dans un programme distinct).
- Commencez la mesure en surveillant les transitoires calciques évoqués par les odeurs « pré-entraînement »/naïfs à une résolution de 512 x 512 px et une fréquence d’images de 4 Hz. Délivrez un stimulus olfactif de 2,5 s flanqué d’une acquisition d’image supplémentaire pendant 6,25 s avant l’apparition de l’odeur (pour établir une valeur de base de F0) et 12,5 s après le décalage d’odeur. Répétez cette opération avec un deuxième odorant, puis avec un troisième odorisant.
- Continuer 3 min après cette mesure avec un conditionnement classique (« dressage ») de la mouche.
- Sélectionnez l’une des odeurs présentées dans la phase de « pré-formation » pour devenir l’odeur CS+ et une autre pour devenir l’odeur CS-. Présentez l’odeur CS+ à l’aide du système de distribution d’odeurs contrôlé par ordinateur pendant 60 s avec douze chocs électriques de 90 V.
- Après une pause de 60 s, présentez l’odeur CS- seule pendant 60 s. Utilisez comme odorants le 4-méthylcyclohexanol et le 3-octanol. Ne présentez pas le troisième odorant (par exemple, 1-octen-3-ol) pendant cet entraînement car il n’est utilisé comme contrôle qu’avant (étape 2.2) et après (étape 2.4) la phase d’entraînement.
- Mesurez à nouveau les transitoires calciques évoqués par les odeurs « post-entraînement » en répétant le protocole de stimulation des odeurs « pré-entraînement » (étape 2.2) 3 minutes après la fin de la phase d’entraînement (étape 2.3).
REMARQUE : Le moment de cette étape doit refléter le temps d’intérêt après la formation de la mémoire (par exemple, effectuez cette étape 3 à 4 minutes après l’étape de conditionnement pour étudier la mémoire à court terme). En règle générale, les mouches peuvent survivre plusieurs heures dans cette préparation.
- Enregistrez les fichiers d’imagerie dans un format approprié (par exemple, Tiff) pour une analyse ultérieure des images.