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Ce protocole est un extrait de Gervaise et Arur, Analyse spatiale et temporelle de ERK active dans la lignée germinale de C. elegans. J. Vis. Exp.(2016).
1. Dissection de vers adultes pour l’obtention de gonades
- Prélever 100 à 150 WT (N2) ou le génotype souhaité des vers au stade de développement souhaité et spécifique (L1, L2, L3, L4, adulte, etc.) dans 100 μL de tampon M9 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Remplissez le tube de la microcentrifugeuse avec 900 μL de tampon M9 (voir tableau des matériaux). Centrifuger les tubes à 1 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min à température ambiante.
- Retirez délicatement 900 μL de la mémoire tampon M9 et jetez-la. Retirez le tampon sous un microscope à dissection pour vous assurer que les vers ne sont pas retirés accidentellement.
- Répétez les étapes 1.2 et 1.3 deux fois de plus avec la nouvelle mémoire tampon M9 à chaque fois. Cela garantit que toutes les bactéries qui ont été transportées avec les vers sont efficacement éliminées.
- Après le lavage final, retirez 900 μL de tampon M9 du tube et jetez-le.
- Transférez les 100 μL restants de tampon M9 contenant les 100 à 150 vers avec une pointe de micropipette de 200 μL dans une boîte de montre en verre à fond plat. Assurez-vous que la pointe de la micropipette est coupée à la marque de 10 μL avant utilisation. Ne pas couper la pointe entraînera le cisaillement des vers.
- Ajoutez 1 à 3 μL de lévamisole 0,1 M dans la boîte de montre en verre contenant les vers dans le tampon M9. Faites tourner doucement le lévamisole et le M9 pour permettre un mélange uniforme jusqu’à ce que les vers cessent de bouger.
REMARQUE : Les stocks de lévamisole peuvent être conservés à -20 °C pour un stockage à long terme. Ici, utilisez la concentration plus élevée de 1 à 3 mM que ce qui a été décrit dans la littérature23 de 0,2 à 0,25 mM de lévamisole afin d’obtenir une perte rapide de mobilité chez les animaux. Si les animaux s’agitent trop longtemps dans la suspension liquide, les modèles de dpERK résultants dans les gonades peuvent être variables (en raison du stress ou du manque de nutrition ou des deux). Des modèles de coloration plus reproductibles ont été obtenus avec du lévamisole de 1 à 3 mM pour la dissection.
- Fixez deux aiguilles de 25 G à deux seringues de 1 mL (la taille de la seringue n’a pas d’importance, le calibre de l’aiguille est critique). Placez une seringue dans chaque main (Figure 1).
- À l’aide d’un microscope à dissection, placez chaque aiguille sous et au-dessus de chaque ver comme illustré à la figure 1 et placez une fine entaille sur le ver près du deuxième bulbe pharyngé dans un mouvement de ciseaux. Après une coupure dans le ver, passez à l’animal suivant jusqu’à ce que tous les animaux dans le plat aient été coupés au moins une fois.
REMARQUE : N’oubliez pas que les étapes 1.8 à 1.9 sont sensibles au temps. Disséquez tous les vers dans la boîte en moins de cinq minutes pour obtenir un modèle dpERK reproductible. Des temps de dissection plus longs entraîneront la désactivation du signal dpERK, en particulier dans la zone 1. Ajustez le nombre de vers par cycle de dissection (c’est-à-dire 50 vers contre 150) si nécessaire pour respecter le temps imparti.
- Dans le cas où une gonade extrudée n’est pas visible lors de la dissection, ne tentez pas une autre incision chez le même animal. Habituellement, cela ne fera que cisailler l’animal et n’entraînera pas l’extrusion de la gonade. Au lieu de cela, passez à l’animal suivant. Les vers où les gonades n’extrudent pas apparaîtront comme tels sur les lames qui seront réalisées en section 6 et pourront être ignorés lors de l’imagerie
REMARQUE : À travers toutes les étapes de dissection et de traitement, il est important de garder à l’esprit que la gonade restera attachée au corps ou à la carcasse. Ne forcez pas la gonade et le corps à l’aide de l’aiguille. Souvent, une déchirure aberrante du tissu gonadique dans le but de séparer la gonade du corps peut entraîner un signal d’anticorps parasites. Le corps/la carcasse peut être ignoré pendant les étapes d’imagerie, et seule la gonade peut être imagée. De plus, les cellules intestinales peuvent parfois servir de contrôles internes/somatiques pour l’anticorps testé.
Figure 1 : Démonstration des positions de l’aiguille pendant les dissections. À gauche : Photographie d’une dissection en cours. Droite : Positions de l’aiguille par rapport au ver. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
