PCR à ver unique : une méthode pour extraire et amplifier l’ADN génomique

Résumé

Source : Prior, H., et al. Un pipeline rapide et facile pour générer des mutants ponctuels génomiques chez C. elegans à l’aide de ribonucléoprotéines CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

Cette vidéo décrit une technique permettant de dépister rapidement un seul nématode pour un marqueur génétique par dépistage par PCR. Dans l’exemple de protocole, nous recherchons l’édition du génome basée sur CRISPR.

Protocole

Le protocole suivant est un extrait de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR et génotypage d’un seul ver

1. Après 1 à 2 jours de ponte, transvaser les F₁s dans des bouchons de tube de bandelettes PCR individuels contenant 7 μL de tampon de lyse de vers de terre à l’aide d’un pic à vis sans fin (tableau 1, figure 1D, jours 4 et 5).
2. Centrifugez les tubes PCR à vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante pour amener les animaux au fond du tube, et congelez les tubes à -80 °C pendant 1 h
   REMARQUE : Les vers peuvent être stockés indéfiniment à -80 °C.
3. Lyser les vers congelés dans un thermocycleur à l’aide du programme suivant : 60 °C pendant 60 min, 95 °C pendant 15 min, maintien à 4 °C.
4. Configurez le mastermix PCR comme indiqué dans le tableau 2.
5. Ajoutez 21 μL de mastermix PCR dans des tubes PCR propres, puis ajoutez 4 μL de lyse parasitaire à partir de l’étape 3. Bien mélanger à l’aide d’une pipette et exécuter le programme PCR en suivant les directives du fabricant (voir le tableau des matériaux).
6. Purifiez les réactions de PCR à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentration d’ADN, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Eluter l’ADN en ajoutant 10 μL d’eau à la colonne de spin.
7. Mise en place d’un mélange d’enzymes de restriction comme indiqué dans le tableau 3.
8. Ajouter 10 μL du mastermix d’enzymes de restriction à chaque réaction PCR nettoyée et incuber pendant 1 à 2 h à 37 °C.
9. Séparez les produits de PCR digérés sur un gel d’agarose à 1,5 % fonctionnant à 120 V à l’aide d’un tampon 1x Tris-acétate-EDTA (TAE).

Résultats

Graphique 1. Ingénierie CRISPR-Cas9 du locus de C. eleganssod-1. (A) Illustration schématique illustrant la structure exon-intron du locus sod-1 chez C. elegans. La barre rouge indique l’emplacement de G93 dans l’exon 3. L’ensemble de paires d’amorces est indiqué par les flèches rouges (F1-R1). (B) Align...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau sans nucléase	Synthego Inc.	fourni avec le kit sgRNA EZ kit
KCl	sigma	Réf. P5405
DNA Clean & Concentrator	Recherche Zymo	D4004
Kit de récupération d’ADN en gel Zymoclean	Recherche Zymo	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0494L
Protéinase K	sigma	Réf. P2308
MgCl2	sigma	Référence M2393
NP-40	sigma	Référence 74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Solution de décontamination	Fisher Scientific	AM9780