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Abstract

Source : Escorcia, W., et al. Quantification de l’abondance des lipides et évaluation de la distribution des lipides chez Caenorhabditis elegans par coloration au rouge du Nil et au rouge de l’huile. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit un protocole pour colorer les lipides de vers entiers et fixés à l’aide d’un colorant rouge du Nil. Pour visualiser spécifiquement les lipides neutres au cœur des gouttelettes lipidiques, imaginez les spectres d’émission verts de C. elegans colorés.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Coloration rouge du Nil (NR) des lipides

1. Préparation d’une solution mère de NR à 5 mg/mL
   1. Dans une bouteille de 500 ml, ajoutez 100 mg de poudre NR à 200 ml d’acétone à 100 %.
   2. Couvrez la bouteille d’une feuille d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
   3. Avant utilisation, remuez la solution pendant 2 h dans l’obscurité.
   4. Pour une utilisation à long terme, conservez la solution mère NR dans un flacon hermétiquement fermé sans aucune exposition à la lumière. Adaptez la solution mère NR en fonction des besoins de recherche. Assurez-vous que la même solution mère est utilisée dans toutes les expériences de coloration NR pour obtenir des résultats de coloration et d’imagerie cohérents.
2. Préparation de la solution de travail NR
   1. Pour chaque 1 mL d’isopropanol à 40 % (v/v), ajouter 6 μL de solution mère de NR.
   2. Préparez 600 μL de solution de travail NR pour chaque échantillon.
      REMARQUE : Préparez une solution de travail NR fraîche juste avant la coloration. Selon les besoins en solution mère NR, utilisez un tube conique gradué de 15 ml ou 50 ml.
3. Préparation des vers pour la coloration lipidique NR
   1. Faire pousser les vers jusqu’au stade L4 précoce à 20 °C sur un milieu de croissance de nématodes (NGM) ensemencé avec des E. coli OP50 logarithmiques.
   2. Lavez les vers de la plaque avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate 1x + Triton X-100 à 0,01 % (PBST) et mettez la suspension de vers dans un tube de microfuge de 1,5 ml.
   3. Centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant et répéter cette étape jusqu’à ce que E. coli soit débarrassé de la suspension.
   4. Ajoutez 100 μL d’isopropanol à 40 % à la pastille de ver et incubez-la à température ambiante pendant 3 min.
   5. Centrifugez les vers à 560 x g pendant 1 min et retirez le surnageant sans perturber la pastille de ver.
      REMARQUE : Utilisez des volumes plus élevés de PBST pour laver les vers des plaques si vous utilisez des plaques plus grandes ou si vous colorez plus de vers par plaque. Ne pas laver les vers dans le PBST plus de 15 minutes avant la fixation de l’échantillon. Effectuez des lavages supplémentaires si le surnageant n’est pas débarrassé des bactéries. Réaliser l’incubation dans de l’isopropanol à 40 % à l’aide d’un nutator ou d’un rocker. Surveillez toujours les tubes pour vous assurer que l’agitation de l’échantillon est complète.
4. Coloration lipidique par NR
   1. Dans l’obscurité, ajoutez 600 μL de solution de travail NR à chaque échantillon. Retournez les tubes trois fois et mélangez complètement les vers dans la solution NR.
   2. Faites pivoter l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.
   3. Après l’incubation, centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et retirer le surnageant.
   4. Ajoutez 600 μL de PBST et incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration NR.
   5. Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et prélever tous les échantillons de surnageant, à l’exception μL. REMARQUE : L’incubation du NR ne nécessite pas d’agitation. L’installation des vers est fréquente au cours de cette étape.
5. Préparation des lames pour l’imagerie microscope
   1. Remettez la pastille de ver en suspension dans le surnageant restant.
   2. Placez 5 μL de suspension de ver sur une lame de microscope et mettez soigneusement une lamelle pour éviter de piéger les bulles d’air.
   3. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles avant d’imager les vers.
   4. Préparez seulement quelques diapositives à la fois. Cela garantira que l’imagerie NR reste constante sur tous les échantillons. La qualité des images colorées au NR diminue après 6 h. Les gouttelettes lipidiques discrètes sont difficiles à observer et la fluorescence de fond augmente, ce qui interfère avec la détection du signal NR.
6. Imagerie de vers colorés au NR
   1. Imagez les vers à un grossissement de 5X pour capturer plusieurs animaux par champ de vision.
   2. Passez à un grossissement de 10X pour une meilleure quantification des vers individuels.
   3. Utilisez le canal FITC/GFP pour imager les vers colorés au NR et essayez différents temps d’exposition pour déterminer les conditions optimales de quantification.
   4. Enregistrez les fichiers au format TIF pour éviter de perdre des données à cause de la compression.
      REMARQUE : Les temps d’exposition typiques varient de 100 à 1000 ms. Ayant un temps d’exposition optimal, utilisez-le pour tous les échantillons afin de maintenir la cohérence de l’imagerie.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator