Fixation à l’éthanol et coloration DAPI : une méthode pour visualiser l’ADN chez C. elegans

Résumé

Source : Clarke, E. K., et al. Manipulation de la ploïdie chez Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Ici, nous décrivons une technique utilisée pour visualiser l’ADN génomique chez des nématodes fixes et intacts. La vidéo comprend un exemple de protocole pour compter la chromatine dans les ovocytes de C. elegans non fécondés.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Les souches tétraploïdes peuvent être validées en comptant le nombre de chromosomes dans leurs ovocytes non fécondés. La microscopie à fluorescence peut être utilisée pour dépister le nombre de paires de chromosomes dans les ovocytes diploïdes non fécondés (avant les divisions méiotiques), si la souche a un marqueur fluorescent pour les chromosomes. En l’absence de marqueurs chromosomiques fluorescents, les nématodes tétraploïdes peuvent être criblés en fixant les nématodes et en les colorant avec un colorant d’ADN ; voir ci-dessous un protocole pour la fixation à l’éthanol et la coloration au dichlorhydrate de 4′,6-diamidine-2′-phénylindole (DAPI) d’animal entier.

Coloration DAPI d’animal entier

NOTE : Les souches tétraploïdes portant 12 paires de chromosomes connectées peuvent être validées en colorant ces animaux et en comptant le nombre de corps DAPI dans ses ovocytes non fécondés.

1. Placez 5 à 10 μL de tampon M9 sur une lame de microscope, puis transférez 6 à 10 nématodes dans la goutte.
2. À l’aide d’un microscope à dissection, prélevez la majeure partie de M9 de la goutte sans retirer les nématodes à l’aide d’un chiffon de nettoyage non pelucheux. Ensuite, ajoutez immédiatement une goutte de 10 μL d’éthanol à 90 % sur les vers. Laissez les vers sécher complètement, mais pas plus de quelques secondes.
3. Dès que l’éthanol s’évapore (cela peut être vu au microscope de dissection), ajoutez 10 μL supplémentaires d’éthanol à 90 % sur les vers.
4. Répétez l’étape 3.1.3 trois fois de plus.
5. Une fois que la dernière goutte d’éthanol s’est évaporée, ajouter 6 μL de colorant DAPI ou Hoechst à la concentration finale recommandée dans le milieu de montage de votre choix (par exemple, une dilution de 1:1 000 d’une concentration de stock de DAPI de 2 ng/μL dans M9). Pour le stockage à long terme des lames, on peut utiliser de la p-phénylènediamine à 0,5 % dissoute dans 20 mM de Tris-HCl, pH 8,8, dans du glycérol à 90 % comme solution anti-décoloration, au lieu de M9 seulement.
6. Couvrez les vers sur la lame avec une lamelle et scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Mesurer au microscope à fluorescence (étape 3.1.7) au moins 10 minutes après l’ajout de la lamelle. Les lames sans anti-décoloration peuvent être conservées quelques jours à 4 °C avant d’être rayées, mais la qualité de la fluorescence commence à décliner au bout de quelques jours.
7. À l’aide d’un microscope fluorescent à un grossissement de 100X, notez le nombre de corps DAPI uniques (probablement des paires de chromosomes uniques) dans l’ovocyte non fécondé le plus mature, qui est immédiatement adjacent à la spermathèque et qui n’a pas encore pénétré dans la spermathèque ou l’utérus.
   1. Pour noter des corps DAPI individuels dans un noyau d'ovocyte, utilisez la mise au point fine du microscope pour vous déplacer lentement du haut du noyau de l'ovocyte vers le bas pendant le comptage. Ensuite, recomptez le même noyau tout en déplaçant le foyer dans la direction opposée (c’est-à-dire du bas vers le haut du noyau) pour confirmer le nombre compté de corps DAPI.
8. Noter l’ovocyte non fécondé le plus mature dans chacune des deux gonades chez au moins dix hermaphrodites par souche stable de Lon. Les ovocytes de type sauvage ont en moyenne 6 corps DAPI, 5 paires d’autosomes et la paire de chromosomes sexuels. La présence de 12 corps DAPI dans l’ovocyte de souches stables de Lon indique que les animaux de cette souche sont soit partiels (4 ensembles d’autosomes, 3 chromosomes X), soit complets (4 ensembles d’autosomes, 4 chromosomes X).
9. Calculez le nombre moyen de corps DAPI observés à partir de plusieurs ovocytes (au moins 10) par souche. Certaines paires de chromosomes se touchent ou se superposent, de sorte que le nombre de corps DAPI dans un ovocyte est souvent inférieur au nombre réel de paires de chromosomes.
10. (Facultatif) Valider davantage les souches Lon stables où le nombre moyen de corps DAPI est de 12 pour tester si elles sont des tétraploïdes pleins (4A, 4X) ou partiels (4A, 3X) par coloration par immunofluorescence contre les protéines de l’axe chromosomique telles que HTP-3. Cette coloration permettra de distinguer les paires de chromosomes en montrant un motif cruciforme à partir de chromosomes uniques non connectés présents dans le tétraploïde partiel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope de dissection	Microscopie mobile	SMZ171
Nom	compagnie	Numéro de catalogue	Commentaires
Coloration
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Nom	compagnie	Numéro de catalogue	Commentaires
Fixation à l’éthanol
Éthanol, pur, 190 Proof (95 %), USP	Koptec, VWR	Référence 89125-166
Nom	compagnie	Numéro de catalogue	Commentaires
M9 Tampon
Chlorure de sodium, qualité biotechnologie	VWR	Référence 97061-278
Phosphate de potassium, qualité anhydre monobasique	VWR	Référence 97062-346
Phosphate de sodium, monobasique dihydraté	Fisher Scientific	AC271750025